肠嗜铬细胞HCN2离子通道对肠道免疫炎症反应的正反馈调节作用研究

The enterochromaffin (EC) cells release serotonin (5-HT) and form a reciprocal signaling loop with the immune cells in the intestinal mucosa. Abnormal 5-HT signaling has been shown to be intimately associated with gut inflammation. We have recently detected expression of the hyperpolarization-activated cyclic AMP gated cation channel 2 (HCN2) in EC cells. Based on a series of pilot experimental data, we hypothesize that HCN2-driven 5-HT release may help maintain an appropriate level of immune defense in normal situation. Under pathological conditions, however, HCN2-driven 5-HT release may initiate and maintain overactive immune and inflammatory responses. In the current proposal, we plan to confirm our preliminary finding that HCN2 drive 5-HT release in cultured EC cells. In particular, we will explore the possible central role of HCN2 in mediating the 5-HT release induced by different cytokines and inflammatory mediators. We will also investigate the correlation between expression of HCN2, TPH1 and gut inflammation in DSS-induced IBD mice as well as IBD patient samples. In addition, we will explore the effects of HCN2 blockers on gut inflammation and GI function (motility and sensory function) in IBD mice. This project may reveal important mechanisms which initiate and maintain overactive mucosal immune and inflammatory response.

肠嗜铬细胞（EC细胞）分泌5-羟色胺（5-HT），与免疫炎症细胞形成交互调节的信号环路，肠道5-HT信号异常与肠道炎症密切相关。我们在前期工作中证实EC细胞高表达超极化激活cAMP门控的阳离子通道2（HCN2）。在一系列预实验的基础上，我们推测：正常情况下，HCN2驱动EC细胞分泌5-HT，维持肠道适度的免疫防御功能；在病理情况下，HCN2以正反馈的方式“点燃”肠道免疫炎症反应。拟在培养的EC细胞，采用膜片钳、钙成像、ELISA及伏安法测定等方法，验证HCN2对EC细胞的调控作用，特别是其在Th1细胞因子和炎性介质刺激5-HT分泌过程中的核心作用；在DSS诱导的炎症性肠病（IBD）小鼠和IBD患者，观察肠道HCN2、TPH1等表达变化规律及与肠道炎症的相关性；探讨HCN2阻断剂对IBD小鼠肠道炎症和疾病进程的影响。本课题有望揭示启动和维持肠道过度免疫炎症反应的新机制。

炎症性肠病（IBD）是十分棘手的临床难题，肠道粘膜异常免疫炎症反应是IBD病理生理进程的核心，目前对肠道免疫炎症反应的调控机制缺乏深入了解，是制约IBD临床治疗效果的主要瓶颈。本项目从肠嗜铬（EC）细胞与免疫炎症细胞交互调控信号环路的视角出发，验证EC细胞表达的HCN2离子通道可能驱动5-HT释放和以正反馈的方式调控肠道炎症。主要研究内容与结果如下：.1. 证明肠嗜铬细胞特异性表达HCN2离子通道，HCN2活化可提高EC细胞兴奋性：采用免疫荧光、qPCR和western blot的方法，在小鼠、大鼠和人的肠道样本，发现EC细胞表达HCN2；建立了原代EC细胞培养，电生理方法证明其表达功能性HCN2通道；鉴定了RIN-14B细胞具有典型的肠道神经内分泌细胞特征，是一种理想的EC细胞模型，并表达HCN2通道；在RIN-14B细胞，HCN2阻断剂可导致膜电位超极化和动作电位发放频率降低；TNFa能提高RIN-14B细胞兴奋性，HCN2阻断剂能逆转这一效应。.2. 证明HCN2通道驱动5-HT释放和增强肠道传入神经活动：在离体肠管样本，采用电生理的方法，证明HCN2活化可促进5-HT释放，继而激活肠道传入神经；在肠道上皮特异性敲除HCN2的小鼠模型，发现血清5-HT水平较野生型小鼠显著降低，从而有力地证明HCN2通道对EC细胞分泌5-HT有重要的调节作用；.3. 揭示HCN2通过提高5-HT释放，参与肠道炎症和肠道感觉与动力障碍：在DSS诱导的急性结肠炎症小鼠，发现HCN2表达增加，血清5-HT水平升高；离体肠管电生理实验发现HCN2阻断剂能逆转DSS诱导的肠道高敏感和高动力；在体预防性或治疗性给药HCN2阻断剂，能显著降低血清5-HT水平，和减轻DSS诱导的肠道炎症和疾病活动指数；在DSS诱导的慢性结肠炎小鼠模型，HCN2阻断剂也能显著降低疾病活动指数和血清5-HT水平；.4. 在炎症性肠病患者，发现IBD活动期患者血清5-HT水平较高；在克隆病患者肠道手术样本，发现严重炎症部、中度炎症部HCN2表达水平较非炎症部位显著上调。.综上，本项目有力地证明HCN2通道可驱动EC细胞释放5-HT和肠道炎症，为靶向EC细胞和HCN2通道防治IBD提供了依据。在本项目资助下，已发表SCI论文2篇，培养硕士和博士研究生各两名。