DNA修复过程中两个重要复合物的结构生物学研究

Cells employ the precise DNA repair signaling pathways to maintain the genome stability. The dysfunction of DNA repair will lead to abnormal cellular processes, which causes many human cancers. In this study, we will investigate two important protein complexes, which function in the upstream and downstream processes of DNA repair, respectively. FancA and FancG form a heterodimeric complex in the interstrand crosslink DNA repair pathway.The FancA-FancG complex recognizes the damaged DNA and recruits other Fanc proteins to form a huge Fanconia anemia core complex, which initiates a crosslink repair signaling. HARP, a member of SNF2 family proteins, is a newly identified ATP-dependent annealing helicase, which catalyzes the rewinding of single-strands in the fork DNAs to form the stable double helix structure in DNA repair. The goal of our study is to uncover the molecular basis of FancA-FancG and HARP's functions in DNA repair by determining their alone structures and complex structures with their cognate DNAs. This study will highly extend our understanding of DNA damage response and can provide direct insights into the related human diseases caused by the mutations of FancA, FancG and HARP genes.

DNA损伤修复是细胞保持基因组稳定性的关键机制，其功能的缺失往往导致人类癌症的发生。本课题研究两个分别在DNA损伤修复途径的上游和下游发挥重要功能的蛋白复合物的结构与功能关系。FancA-FancG复合物识别特定形状的DNA，募集其他Fanc蛋白，开启交联DNA损伤修复机制，修复遭受链间交联损伤的DNA。HARP蛋白是一个独特的退火解旋酶，能够利用ATP水解所提供的能量，将分叉DNA中的两条单链DNA退火合并成一条结构稳定的双链DNA，以保护修复好的DNA。本项研究的目标是通过解析FancA-FancG复合物和HARP蛋白晶体结构、以及它们与DNA的复合物结构，结合其他生化实验，揭示FancA-FancG和HARP重要生理功能的结构基础，阐明它们的分子机制，分析它们基因突变导致人类相关疾病发生的原因。该研究将不仅促进人们对DNA损伤修复分子机理的了解，也将有利于相关疾病的治疗和药物设计。

在面上项目的资助下，我们按照实验计划对DNA损伤修复信号通路中两个关键蛋白HARP和FancA-FancG复合物进行了长期和深入的结构研究，并且结合实验室课题进展的具体情况，对该项目进行了扩展，完成了4个项目的研究工作，在Science、Nature Structural & Molecular Biology、PNAS以及JBC等杂志上共发表6篇论文。首先，我完成了HARP蛋白和FancA-FancG的纯化和结晶工作，我们获得了HARP蛋白的单个蛋白晶体以及其与DNA复合物的晶体，虽然它们的衍射分辨率不是很高，但是为进一步的研究提供了坚实的基础。我们进一步优化了FancA-FancG的晶体，尝试多种方法，但是未能提高该复合物晶体的衍射分辨率，迫于实验室课题进展的需求，将相应的研究力量扩展到了其他课题中。第二，我们利用面上项目的部分资金，解析了创伤弧菌关键毒素分子MARTX的效应因子RID结构，发现其与人类脂肪酰基转移酶HRASLS3具有结构相似性，通过生化和细胞实验，证明了RID是一个长链脂肪酰基转移酶，特异修饰宿主关键分子Rho家族小G蛋白，从而拮抗宿主免疫防御反应。该研究成果以通讯作者发表在Science杂志上。第三，我们通过解析噬菌体Anti-CRISPR蛋白AcrF3与病原菌I-F型CRISPR-Cas免疫系统效应因子Cas3的复合物结构，在国际上首次揭示噬菌体蛋白抑制病原菌CRISPR-Cas免疫系统的分子机制，该研究论文以通讯作者发表在Nature Structural & Molecular Biology期刊上；第四，我们通过解析嗜肺军团菌接头蛋白复合物IcmS-IcmW的晶体结构，发现IcmS-IcmW在调节肺军团菌IVb型分泌系统中具有双功能作用的分子机制：在细菌胞质中可以发挥类似分子伴侣的作用，促进效应蛋白去折叠，帮助效应蛋白分泌，同时也是细菌内膜上DotL-T4CP复合物的固有成份，募集LvgA蛋白，调节效应蛋白的分泌，相关研究论文以通讯作者发表在PNAS上。第五，我们通过解析wnt信号通路受体LGR4与配体Rspo1的复合物结构，发现LGR4-6家族受体识别Rspo家族配体分子的单一结合的识别机制，对全面了解Wnt信号通路和药物开发Rspo家族蛋白具有重要意义，相关研究论文以通讯作者发表在JBC上。