申克孢子丝菌黑素对抗原呈递调控因子CIITA功能的影响及其作用机制

双相真菌申克孢子丝菌(Ss.)产生的黑素是一种重要的促进真菌播散的毒力因子，现有研究表明Ss.黑素可以抵御巨噬细胞的吞噬杀伤，但其是否存在其他对抗免疫系统的机制尚不清楚。有效抗Ss.免疫依靠天然免疫与获得性免疫共同作用，抗原呈递是免疫应答中启动获得性免疫的环节，并可增强天然免疫。二类转录激活因子（CIITA）通过调节MHC II分子的表达发挥着调控抗原呈递功能的核心作用。本课题首次研究Ss.黑素对CIITA功能的影响，使用液态芯片技术、RT-PCR等方法，分组观察提取的Ss.黑素颗粒、产黑素Ss.及其白化变种被小鼠巨噬细胞吞噬后，各组细胞内CIITA及其上游启动子和下游产物MHC II分子表达和分布的变化，并检测各组巨噬细胞激活小鼠T细胞产生细胞因子的能力，以阐明Ss.黑素是否可以抑制抗原呈递功能，进一步明确Ss.黑素对抗免疫系统杀伤的机制，为开发以黑素为靶点的新疗法提供依据。

黑素是孢子丝菌复合体的重要毒力因子，以往研究发现，黑素通过抑制巨噬细胞吞噬和氧化杀伤等天然免疫功能来提高孢子丝菌的存活能力。但是，黑素是否具有更复杂的免疫抑制功能尚不明确。本项目通过对产黑素球形孢子丝菌（MEL+）诱导突变来获得白化株（MEL-），并提取纯化黑素颗粒（MG），进行对照研究。主要内容为研究对照组巨噬细胞、吞噬MEL+、MEL-和MG后的巨噬细胞，抗原呈递相关因子的水平差异；研究对照组、吞噬MEL+和MEL-的巨噬细胞与CD4+ T细胞共培养后，T细胞分泌细胞因子的差异；研究MEL+和MEL-在小鼠感染模型中的毒力差异。本研究发现，MEL-的菌丝相孢子相对于MEL+孢子能够显著上调CIITA、PIV、MHC class II和CD86的表达，并可以显著增加巨噬细胞分泌NO和TNF-α；酵母相由于不产生色素，因此两组CIITA、MHC classII水平无显著差异；MG被巨噬细胞吞噬后，巨噬细胞分泌MHC class II、CD80与对照组相比无显著差异，CD86升高；与吞噬MEL+巨噬细胞共培养后的CD4+ T细胞，与吞噬MEL-巨噬细胞共培养后的T细胞相比，分泌IL4比例升高、分泌IFN-γ比例降低。而IL17、Foxp3、IL10、IL2的分泌比例两组间无显著差异。小鼠腹腔感染模型中，感染21天后MEL+组小鼠脾脏重量显著高于MEL-组，肺、肝、脾、肾、睾丸中单位质量的真菌载量MEL+组亦显著高于MEL-组。两组腹腔巨噬细胞MHC class II表达水平差异与体外实验结果相符。这些结果提示孢子丝菌黑素能够抑制巨噬细胞的抗原呈递功能和杀伤功能，还可以干扰巨噬细胞介导的CD4+ T淋巴细胞分化，抑制th1反应，使之向th2反应倾斜，从而发挥免疫逃逸作用，提高孢子丝菌在体内的毒力和侵袭力。且黑素发挥保护作用的过程，与其在真菌细胞上特定的分布方式有关，游离的黑素并不能产生抑制抗原呈递功能的作用。本研究进一步揭示了黑素这一保守而重要的真菌毒力因子的作用机制，阐明了其在巨噬细胞激活和抗原呈递过程中的作用和对CD4+ T细胞分化的影响，为明确孢子丝菌和机体免疫之间的相互作用提供了新的理论。