申克孢子丝菌黑素对TLR4受体介导的巨噬细胞自噬的影响及其机制

Melanin is an important virulence factor of Sporothrix schenckii (Ss). It can resist phagocytosis and killing of the fungus by macrophage. Recently we have demonstrated that melanin can also inhibit antigen presentation by down-regulating MHC II expression in macrophage. Latest research showed that fungal melanin has influence on autophagy marker LC3 molecule. As the immune function of macrophage depends on cell autophagy, the anti-macrophage effect of melanin may be associated with its interference to cell autophagy. TLR4 is the most important PRR in recognition of Ss. It is also the key receptor in the inducement of macrophage autophagy. In our previous research, we have observed that macrophage autophagy was boosted after engulfment of Ss, and melanin can down regulate the expression of TLR4. Therefore, we speculate that Ss melanin inhibits macrophage function by interfering TLR4 induced cell autophagy. In this project, we intend to use fluorescent protein labeling and RNAi technique, to study the temporal and spatial regulation of macrophage autophagy in anti-sporothrix immune response, and the influence of melanin on it. This project will help to elucidate the mechanism of Ss melanin’s resistance against macrophage, and to provide new scientific evidence for analyzing the complicated interactions between Ss and host immunity.

黑素是申克孢子丝菌（Ss.）重要的毒力因子，可对抗巨噬细胞吞噬杀伤，我们发现黑素还可通过降低MHC II表达抑制抗原呈递。最新研究显示真菌黑素能影响自噬标志物LC3的分布，而自噬是巨噬细胞对抗微生物感染的重要机制之一，提示黑素抗巨噬细胞的作用可能与干扰自噬有关。TLR4是识别Ss.的重要受体，同时亦是介导巨噬细胞自噬的关键受体。我们发现Ss.可诱导巨噬细胞发生自噬，且黑素可抑制TLR4的表达。故此推测Ss.黑素可能通过抑制TLR4介导的自噬调控通路，影响巨噬细胞功能。本项目拟应用荧光蛋白标记、RNAi等分子生物学方法，旨在阐明Ss.诱导巨噬细胞自噬的时空规律及黑素对其影响，明确黑素对TLR4介导的自噬信号通路的作用机制。本项目的完成将有助于拓展对黑素抵抗巨噬细胞杀伤机制的认识，为解析Ss.感染与宿主免疫间的复杂作用提出科学依据。

黑素是申克孢子丝菌（Ss.）重要的毒力因子，可对抗巨噬细胞吞噬杀伤，我们发现黑素还可通过降低MHC II表达抑制抗原呈递。最新研究显示真菌黑素能影响自噬标志物LC3的分布，而自噬是巨噬细胞对抗微生物感染的重要机制之一，提示黑素抗巨噬细胞的作用可能与干扰自噬有关。Toll样受体是识别Ss.的重要受体，同时亦是介导巨噬细胞自噬的关键受体。我们发现Ss.可诱导巨噬细胞发生自噬，且黑素可抑制Toll样受体的表达。故此推测Ss.黑素可能通过抑制Toll样受体介导的自噬调控通路，影响巨噬细胞功能。我们首先利用透射电镜、激光共聚焦、wb等方法，首次发现申克孢子丝菌可以诱导人单核细胞系THP-1细胞发生自噬；通过比较黑素野生株（MEL+）和白化突变株（MEL-）对THP-1细胞诱导细胞自噬显示，MEL-也同样可以诱导THP-1 细胞发生自噬，自噬标志分子表达变化较MEL+显著；MEL+和MEL-均可诱导THP-1细胞产生ROS，并使IL-1β、IFN-γ、IL-6和TNF-α表达升高，然而MEL-加入黑素后，ROS产量降低，细胞因子的表达受抑制；申克孢子丝菌可以使TLR（TLR2和TLR4）受体表达升高，而比较MEL+和MEL-对THP-1细胞TLR受体的表达变化表明，TLR2变化更为显著；当TLR2经siRNA表达受抑制时，MEL+、MEL-组与THP-1细胞共孵育后，自噬标志分子LC-II、Beclin1、p62与TLR2未敲减组表达水平差异显著；THP-1细胞经TLR2 敲减后，MEL+和MEL-诱导THP-1细胞生成ROS的量明显下降，并且细胞因子均显著降低。MEL+组与MEL-组均能诱导THP-1细胞 MyD88 和 TRIF 表达升高，而黑素可以抑制MyD88 和 TRIF 的表达；MEL+组与MEL-组均能诱导抗原呈递分子MHC II和转录因子CIITA表达显著升高，加入自噬激活剂，MHC II和CIITA表达显著降低，而加入自噬抑制剂后，MHC II和CIITA表达无变化。本研究首次证明申克孢子丝菌可以诱导巨噬细胞发生自噬，而黑素可以抑制细胞自噬过程。本项目的完成有助于拓展对黑素抵抗巨噬细胞杀伤机制的认识，这对重新认识黑素的毒力作用和自噬过程在感染性疾病的作用，奠定了实验基础。