线粒体融合蛋白Mitofusin2在心脏中的作用及作用机制

已知Mitofusin 2参与介导线粒体外膜的融合，其基因突变与Charcot-Marie-Tooth 综合征密切相关。而Mitofusin 2广泛表达于全身多种重要组织器官，并以心脏组织中表达量最高，但对其在心脏中的作用却尚未开始研究。我们前期研究结果显示，Mitofusin 2介导氧化应激所致心肌细胞调亡，且高表达Mitofusin 2本身即可诱导心肌细胞调亡，并且不依赖于其线粒体融合功能，提示Mitofusin 2在心肌细胞中可能通过其它机制起重要的功能调节作用。本课题构建了Mitofusin 2基因敲除小鼠及转基因小鼠模型,拟结合心肌肥厚、心梗等病理实验模型，从整体、组织、细胞及分子水平，探讨上调及下调Mitofusin 2基因及其表达蛋白对心脏功能的影响、Mitofusin 2在心脏中的生理及病理作用及作用的信号机制、以及Mitofusin 2调控心肌细胞生长的作用及其机理。

为了研究线粒体融合蛋白Mitofusin 2在心脏中的功能, 我们构建了Mitofusin 2第四外显子flox小鼠,并与心肌特异性表达cre酶的MLC2v工具鼠进行杂交, 建立了心肌特异性Mitofusin 2基因敲除小鼠模型。通过 PCR和Western鉴定,成功在心肌中敲除了Mfn2。电镜观察结果显示，与预期不同，Mitofusin 2基因敲除小鼠心脏中，并未观测到断裂或小的线粒体。相反，与对照组相比，Mitofusin 2缺失心肌细胞内肥大线粒体的比例显著增加。此外，心肌细胞内出现自噬小体及多层膜内质网样结构堆积等现象,而LC3II的增加进一步说明Mitofusin 2缺失导致心肌自噬增加。自噬体增加可以由两种原因引起，自噬产生增加或自噬体降解受阻。而Mitofusin 2缺失心肌细胞内p62蛋白的增加，提示我们自噬体降解受阻。为进一步探讨Mitofusin 2介导心肌细胞自噬体堆积的可能机制，我们对Mitofusin 2基因敲除小鼠心脏进行离体灌流，以药物阻断自噬体与溶酶体结合从而阻断自噬体降解，或以缺血再灌注模型诱导自噬现象。结果表明，心脏缺失Mitofusin 2既不影响自噬的产生，也不影响溶酶体的产生，而自噬小体的堆积是由于自噬体与溶酶体的融合受阻，即自噬终末步骤—自噬体降解发生障碍所致。在培养的心肌细胞中，下调Mitofusin 2蛋白水平诱导出类似现象，即自噬小体和溶酶体的融合减少，而在此基础上表达Mitofusin 2蛋白，则可以逆转此现象，使自噬小体和溶酶体的融合恢复到正常水平，进一步证实了mitofusin 2基因缺失使自噬体与溶酶体的融合受阻，从而导致自噬体堆积。在整体水平，mitofusin 2基因敲除导致心肌细胞脂质代谢发生紊乱，线粒体呼吸功能降低。尽管mitofusin 2基因敲除小鼠的心功能与对照相比，在17月龄时才表现出心脏收缩功能的明显下降，但对6月龄小鼠心脏进行缺血再灌注损伤刺激，发现mitofusin 2基因敲除小鼠心脏对缺血再灌注损伤的耐受力降低，表现为线粒体膜电位的显著丢失。因此，我们的研究结果表明， 心肌细胞中，mitofusin2在介导自噬小体和溶酶体融合过程中发挥重要作用，mitofusin2缺失使自噬发生障碍，进而影响心肌细胞代谢，并最终导致心脏功能受损。研究论文已于2012年6月发表在J Biol Chem.