Cd超富集芜菁品种中金属耐受蛋白BrrMTP2的功能研究

Heavy metal (HM) pollution in soil is a global environmental problem. One of the significant methods for solving HM pollution problem is to reduce HM intake risk of crop plants or to increase phytoremediation efficiency of HM contaminated soil by genetic engineering technology. We previously found that turnip had strong ability to tolerate and accumulate cadmium (Cd). Based on the transcriptome analysis of a Cd-hyperaccumulating turnip landrace KTRG-B14, we screened a prominently Cd-induced gene BrrMTP2. This gene could significantly improve Cd tolerance capacity of transgenic plants when transformed into wild Arabidopsis thaliana. In order to determine the role of this gene in turnip response to Cd stress, we are planning to obtain the BrrMTP2-overexpression turnip plants and its mutant by using pBI121 expression vector and CRISPR-Cas9 system, respectively. We will compare the effects of gene overexpression or deletion on Cd accumulation in different turnip tissues and Cd subcellular distribution, in combination with gene spatial expression and protein subcellular localization, to analyze the function of target gene. The results will improve understanding of the molecular mechanism of Cd uptake and transport in plants, and provide theoretical basis and genetic resources for combating Cd pollution by genetic engineering technology.

土壤重金属污染是全球性的环境问题。利用基因工程技术降低农作物中重金属摄入风险或提高污染土壤的植物修复效率是解决重金属污染的重要途径之一。我们前期发现芜菁对镉（Cd）的耐受和富集能力很强，通过对Cd超富集芜菁品种KTRG-B14进行转录组分析，我们筛选到一个显著受到Cd诱导表达的基因BrrMTP2。将该基因转入野生型拟南芥后发现转基因植株对Cd的耐受性显著提高。为了阐明BrrMTP2基因在芜菁响应Cd过程中的作用机理，本项目拟利用pBI121表达载体和CRISPR-Cas9系统分别获得该基因过表达和敲除的芜菁植株，通过比较基因过表达和缺失对芜菁不同部位Cd积累量及细胞中Cd分布的影响，结合基因的组织表达和蛋白亚细胞定位来分析其功能。本研究将促进对植物转运Cd的分子机制的认知，并为通过基因工程技术防治Cd污染问题提供理论基础和基因资源。

我国耕地土壤镉（Cd）污染十分严重，解析植物响应Cd的分子机制，是利用基因工程培育Cd低富集农作物品种或Cd高富集植物修复资源的重要基础。本项目按研究计划对Cd超富集芜菁品种KTRG-B14中BrrMTP2基因的功能开展研究，通过将BrrMTP2基因转入拟南芥中发现它能促进植物对Cd的耐受性。由于遗传转化体系的限制，项目未能成功在芜菁中实现目的基因的过表达和敲除来验证其功能。在不改变研究材料和不偏离研究目的的基础上，本项目开展了以下3方面的研究内容：（1）芜菁KTRG-B14和KTRG-B36品种根部响应Cd胁迫的比较转录组学研究。结果发现：2个芜菁品种根部都启动了谷胱甘肽（GSH）代谢和抗氧化系统来应对Cd胁迫，但2个品种中具体的抗氧化过程又有所不同；2个品种中不同的参与Cd转运的基因可能决定了它们不同的Cd积累和分布。此外，一些特异性上调表达的基因可能有助于KTRG-B14富集更多的Cd。（2）芜菁KTRG-B14品种叶片响应Cd胁迫的转录组学和蛋白质组学联合分析。结果发现：类黄酮合成、GSH代谢、抗氧化酶、热休克蛋白、蛋白质乙酰化修饰等可能在芜菁叶片耐受Cd胁迫中起到重要作用。同时，一些金属转运蛋白可能参与了Cd在芜菁叶片中的积累和分布，通过转基因验证了芜菁BrrHMA2.1基因能降低转基因拟南芥对Cd的富集。（3）芜菁KTRG-B14品种叶片响应Cd胁迫的琥珀酰化修饰组学分析。共鉴定到547个琥珀酰化修饰位点，定量分析发现9个位点的修饰强度受到Cd胁迫的显著影响。其中，1个乙醇酸氧化酶（K150），1个过氧化氢酶（K396）和1个谷胱甘肽S-转移酶（K197）上的修饰强度变化可能影响了蛋白质的酶活性来增强芜菁叶片对Cd的耐受性。该项目为植物响应Cd胁迫的机制提供新的见解，研究结果有望为通过分子育种培育Cd低富集或高富集植物资源提供基因资源。项目发表研究论文2篇，协助培养2名硕士研究生，按计划完成考核指标。