相容性溶质甜菜碱添加对大肠杆菌代谢调节的机理研究

Osmotic stress caused by high concentration of substrate consumption and product accumulation is a key limiting factor for the efficient synthesis of target products in industrial fermentation. Glycine betaine is an important compatible solute which is directly imported into E. coli cells in response to the osmotic change, but its mechanism is still unclear. In the previous study, a high-yield threonine producer of E. coli was obtained by metabolic engineering. The transcription of zwf and corresponding enzyme activity of glucose-6-phosphate dehydrogenase were significantly promoted by glycine betaine addition, which undoubtedly contributed to a metabolic flux increase of the pentose phosphate pathway that provided more NADPH for threonine synthesis. In order to systematically clarify the function of glycine betaine, in this project, we tend to use proteomics and metabolomics to study the effect of glycine betaine supplementation on the metabolic regulation in E. coli during the fermentation. The differential proteins and metabolites will be analyzed and the related genes transcription and enzyme activity will be determined to investigate the mechanism of glycine betaine. In addition, we tend to use CRISPR/Cas9 technology to modify the key genes, and the osmotic tolerance and threonine production capacity of E. coli will be determined after modification. The correlations between key genes expression and osmotic regulation in E. coli will be explored to provide useful information on rational construction of osmophilic industrial producer.

工业发酵中高浓度底物消耗和产物积累所形成的渗透胁迫是制约目标产物高效合成的关键因素。甜菜碱是大肠杆菌应对渗透压变化向胞内运输的一种重要的相容性溶质，但其作用机制尚不清楚。前期研究中，申请人以构建的大肠杆菌苏氨酸高产菌作为研究对象，发现甜菜碱的加入能够提升6-磷酸果糖激酶的基因转录水平和酶活力，增加发酵稳定期磷酸戊糖途径的代谢流量，从而为苏氨酸的合成提供更多的还原力。为了系统研究甜菜碱的功能，本项目拟利用蛋白组学和代谢组学方法测定发酵过程中甜菜碱添加引发的大肠杆菌代谢网络的动态变化。对差异蛋白质和代谢物进行功能分析，并测定相关基因的转录及酶活力，解析出甜菜碱的作用机制。此外，采用CRISPR/Cas9技术对关键基因进行遗传改造，测定改造前后大肠杆菌的渗透压耐受力和发酵产酸能力，探究大肠杆菌中关键基因表达与渗透调节的关系，为合理构建耐高渗的工业生产菌株提供指导。

甜菜碱作为一种新型的发酵助剂，能够有效提升苏氨酸生产菌株Escherichia coli THRD的发酵性能，但其对菌株的代谢调节方式尚不明确。本项目使用DIA蛋白组学技术分析甜菜碱作用下大肠杆菌胞内蛋白的表达变化，筛选获得了发酵对数前期的差异蛋白621个，发酵稳定期的差异蛋白798个，这些差异蛋白主要参与氨基酸合成、能量代谢、环境应激反应以及辅因子和维生素代谢。使用高效液相色谱-飞行时间质谱联用技术（UPLC Q-TOF MS）分析甜菜碱作用下大肠杆菌胞内代谢物的含量变化，筛选获得了发酵对数中期的差异代谢物495个，发酵对数后期的差异代谢物595个，这些差异代谢物主要参与氨基酸代谢、碳代谢、辅因子和维生素代谢、核酸代谢、能量代谢以及膜的运输和物质传递。围绕苏氨酸合成解析甜菜碱对大肠杆菌的代谢调节机制，甜菜碱的加入能够改变糖酵解以及磷酸戊糖途径的碳流分配，使得更多的葡萄糖流经磷酸戊糖途径为苏氨酸的合成提供还原力；能够动态调节磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶催化的CO2固定反应和三羧酸循环，使细胞能够积累更多的草酰乙酸和谷氨酸用于合成苏氨酸；能够减弱丝氨酸、赖氨酸和异亮氨酸的合成，减少3-磷酸甘油醛、天冬氨酸以及苏氨酸的支路代谢。在组学研究的基础上，验证了多个受甜菜碱调控的基因启动子（包括正向调控和负向调控），并通过启动子替换策略提升了THRD的苏氨酸产量和糖酸转化率。建立了基于阿拉伯糖诱导的CRISPRi代谢干扰体系，调控EMP、TCA和支路代谢途径中11个基因的转录水平，通过动态干扰中心代谢提升苏氨酸的合成效率。研究结果为深入理解甜菜碱对大肠杆菌的代谢调节机制，以及工业生产菌株的代谢工程改良奠定了基础。