长链非编码RNA CFL1-AS1调控牛成肌细胞增殖分化的机制研究

Dissecting the regulatory mechanism of muscle growth and development is necessary for the molecular breeding and meat quality improvement of agricultural animals. Previously, we have identified a novel antisense long non-coding RNA CFL1-AS1 which overlapped with antisense chain of CFL1 gene, and qRT-PCR showed that CFL1-AS1 was low expression in adult bovine muscle tissue specifically. Trans prediction reveals that CFL1-AS1 can regulate the expression of CFL2 gene remotely; RNAhybrid analysis found that CFL1-AS1 can be competing endogenous RNA (ceRNA) to regulate the expression of miR-125 a/b, and miR-125b can inhibit myoblasts differentiation; TargetScan indicates miR-125a/b has IGF2 gene binding site. Therefore, this project aims to edit CFL1-AS1 by using CRISPR/CAS9 technology, to identify the transcription factors which regulate CFL1-AS1, to elucidate the signal transduction network of CFL1-AS1 /miR-125a/b /IGF2 pathway to regulate the proliferation and differentiation of bovine myoblasts. Our results will comprehensively elucidate the regulatory mechanism of CFL1-AS1 on myoblasts proliferation and differentiation at the levels of transcription regulation, functional mechanism and signal transduction. Not only fill the deficiency of antisense lncRNA mechanisms on the field of bovine muscle growth and development, but also provide new molecular markers and theoretical basis for genetic improvement and high efficiency of beef cattle breeding.

研究肌肉生长发育的调控机制对牛的快速高效选育及肉品质的遗传改良具有重要指导意义。申请人前期鉴定到一个新的反义型长链非编码RNA CFL1-AS1，在牛肌肉组织中特异性低表达；Trans作用CFL1-AS1调控肌肉基因CFL2的表达；RNAhybrid分析发现CFL1-AS1竞争性吸附miR-125a/b，miR-125b可抑制肌细胞分化；TargetScan表明miR-125a/b存在IGF2基因结合位点。因此，本项目拟利用CRISPR/CAS9技术编辑CFL1-AS1，鉴定调控CFL1-AS1表达的转录因子，阐明CFL1-AS1、miR-125a/b、IGF2途径调控肌细胞增殖分化的信号转导网络。以期从转录调控、功能机制、信号转导三个层面，解析CFL1-AS1调控牛肌细胞增殖分化的作用机制，填补反义型lncRNA在牛肌肉生长发育这一研究领域的不足，为牛遗传改良和分子育种提供新的研究思路。

我国牛肉市场具有巨大的行业空间，但高品质牛肉的自给率较低。由于牛肉的产量和质量与肌纤维的数量和体积密切相关，其动态反映为肌细胞增殖和分化的过程，这一过程又涉及编码基因和非编码基因（包括lncRNAs）的紧密配合。因此，为进一步提高牛的产肉量及肉品质，本项目在前期原创性研究的基础上，从分子层面开展反义型非编码基因lncRNA CFL1-AS1调控牛成肌细胞增殖分化的分子机制研究。在功能层面，明确CFL1-AS1对肌细胞增殖分化的调控作用；在转录水平，明确转录因子对CFL1-AS1转录活性的调控机制；在转录后水平，明确CFL1-AS1与亲本基因CFL1之间的调控关系。首先，本项目通过RACE技术得到CFL1-AS1的全长序列616bp；细胞定位发现，CFL1-AS1主要分布在细胞质；利用pcDNA3.1和pSpCas9(BB)-2A-GFP（pX458）表达载体分别成功构建CFL1-AS1真核过表达和敲除载体；在肌细胞中过表达CFL1-AS1，可促进细胞增殖，抑制细胞凋亡，显著降低细胞周期G0/G1期比例，S期细胞显著增加，促进G2/M期进程；在肌细胞中干扰CFL1-AS1，可抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，显著增加细胞周期G0/G1期比例，S期细胞显著降低，对G2/M期进程调控不明显；分别在肌细胞中转染CFL1-AS1过表达或干扰载体24小时后，诱导肌细胞分化5天，发现CFL1-AS1在分化不同时期呈现出正调控其亲本基因CFL1的表达趋势，负调控肌细胞分化标志因子MYOG、MYOD、MYH4、MYH6、Mylk及Mef2c的相关表达量，表明CFL1-AS1在一定程度上可抑制成肌细胞的分化；CFL1与CFL2作为Cofilin家族的2个亚型，与肌肉的生长发育密切相关，CFL1在一定程度上抑制成肌细胞的分化，CFL2则可促进成肌细胞的分化；CFL1-AS1与亲本基因CFL1提供潜在的lncRNA-mRNA调节对，CFL1在受到CFL1-AS1正调控的同时，其调控模式发生动态变化，可反向激活CFL1-AS1的表达，抑制成肌细胞分化。本研究明确了CFL1-AS1对牛成肌细胞增殖分化的影响，从不同层面解析了CFL1-AS1调控牛肌肉生长发育的分子机理，填补了反义型lncRNA在牛肌肉生长发育这一研究领域的不足，为肉牛遗传改良和高效育种提供了新的分子标记和选育思路。