长链非编码RNA-lnc23协同PFN1调控牛成肌分化的作用机制研究

Numerous studies have confirmed that lncRNA plays an important role in regulation of muscle development and differentiation, but only a few studies on the mechanism of lncRNA regulation on bovine muscle development have been reported. Our group had identified a lncRNA-lnc23, which could significantly promote differentiation of bovine myoblast. In addition, PFN1 were verified as a bind protein of lnc23, which inhibited bovine myogenic differentiation in our previous study. Based on the preliminary results, we speculated that lnc23 synergistic with PFN1 might play an important regulatory effect on myoblast differentiation. In this study, to verify the hypothesis, we try to analyze the effect of PFN1 on the differentiation of bovine myoblast and the regulation action of lnc23 on PFN1. And target proteins of lnc23-PFN1 will be identified by CoIP. Furthermore, signaling pathways and effector genes regulated by lnc23-PFN1-target protein will be confirmed through bioinformatics analysis and experimental verification. As a result, the study will reveal the regulation mechanism of lnc23-PFN1 on myoblast differentiation and will provide a new theoretical basis for the mechanism of lncRNA regulating the bovine muscle development and new targets for the molecular breeding of beef.

众多研究已经明确lncRNA对肌肉的发育分化具有重要调控作用，但关于lncRNA调控牛肌肉发育的分子机制研究报道较少。课题组前期鉴定到一个对牛成肌分化有显著促进作用的lncRNA-lnc23，并鉴定到lnc23与PFN1蛋白结合，初步实验结果发现PFN1能够抑制牛成肌细胞的分化，据此推测lnc23与PFN1互作对成肌分化有重要的调控作用。本项目拟以此为基础，以牛成肌细胞为模型，研究PFN1对牛成肌分化的影响，并分析lnc23对PFN1的调控作用及方式，进一步利用CoIP技术挖掘lnc23-PFN1的下游靶蛋白，再结合生物信息学分析和实验验证确定lnc23-PFN1-靶蛋白调控的信号通路及效应基因，最终揭示lnc23-PFN1协同调控成肌分化的作用机制，为lncRNA调控牛肌肉发育的机制研究提供新的理论依据，也为肉牛的分子育种提供新的靶点。

脊椎动物肌肉的生长发育是一个极其复杂、连续的过程，期间受到很多调控因子和信号通路的作用。本项目前期获得了一个对成肌分化有促进作用的lncRNA-lnc23，并且鉴定到lnc23的一个结合蛋白PFN1。PFN1是一个actin隔离蛋白，能够阻止G-actin发生聚合，进而阻止细胞融合，而细胞融合是肌细胞发育必不可少的过程，但是在本项目前关于PFN1对成肌分化的作用鲜有报道，因而本项目研究了PFN1对成肌分化的作用及其分子机制。本项目首先分析了在牛成肌细胞中lnc23对PFN1的调控作用，发现lnc23对PFN1蛋白的表达没有显著影响，推测lnc23与PFN1结合可能只影响PFN1功能而并不影响其表达。接着我们证实了PFN1能够显著抑制成肌细胞增殖和分化。本项目利用免疫共沉淀结合质谱技术分析了PFN1的结合蛋白，通过生物信息学分析及实验验证筛选到一个候选靶蛋白Cdc42，并且发现PFN1能够激活Cdc42，同时证实Cdc42也能够抑制牛成肌细胞的增殖和分化。为了揭示Cdc42和PFN1相互作用抑制成肌细胞增殖分化的分子机制，我们探究了它们作用的信号通路。实验结果表明在牛成肌细胞中Cdc42能够激活PAK，并且PAK能够抑制成肌分化。我们进一步发现在牛成肌细胞中PAK能够激活JNK，并且JNK也能够抑制牛成肌细胞的分化，而且PFN1或Cdc42在牛成肌细胞中能够激活JNK。综合所有结果，本项目揭示了PFN1抑制牛成肌细胞分化的分子机制：PFN1能够激活Cdc42，活化的Cdc42进一步激活PAK，进而激活JNK，活化的JNK可以抑制牛成肌细胞的成肌分化。通过本项目的实施，我们揭示了PFN1对肌生成的抑制作用及其分子机制，丰富了PFN1在成肌细胞中的生物学作用，为理解肌肉发育过程中复杂的基因表达调控网络提供新的参考，同时为牛的肉用性状的遗传改良提供了一个新的靶点参考和依据。