SIRT6在血管紧张素Ⅱ诱导足细胞胆固醇蓄积与损伤中的作用及分子机制

Lipid accumulation in podocyte is closely related to podocyte injury and progression of chronic kidney disease (CKD), but the exact mechanism of the disregulated lipid metabolism remains unclear. Whether the renin angiotensin system (RAS) activation, a main risk factor for CKD progression, affects podocyte lipid metabolism is still unknown. SIRT6 plays an important role in regulation of cellular cholesterol. We have recently found that angiotensinⅡ(AngⅡ) can inhibit SIRT6 expression and induce lipid droplet generation in podocyte. This project intends to investigate the role and the potential mechanism of SIRT6 in regulation of podocyte cholesterol accumulation and podocyte injury. Firstly, we will evaluate the expression of SIRT6, cholesterol accumulation and podocyte injury in AngⅡ-infused animals, cultured human podocytes and renal biopsy specimens of patients with podocytopathies; Secondly, we will explore the mechanism of SIRT6 in regulation of podocyte cholesterol metabolism and podocyte injury via altering the expression of SIRT6 with its recombinant plasmid, stable SIRT6 knock out cell line by CRISPR/Cas9 technology and specific podocyte SIRT6 knockout mice; Finally, we will evaluate the effect of cholesterol accumulation on podocyte injury through changing cellular cholesterol content by specific inhibitors. This investigation will provide a theoretical evidence for a new therapeutic target of podocytopathy.

足细胞脂质蓄积与足细胞损伤及慢性肾脏病（CKD）进展密切相关，但导致足细胞脂质蓄积的机制仍不清楚。肾素血管紧张素系统激活这一CKD进展的主要危险因素是否影响足细胞脂代谢也未见报道。SIRT6是细胞胆固醇代谢的重要调节分子，我们前期研究发现血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）可抑制足细胞SIRT6表达和诱导足细胞胆固醇蓄积。本项目拟研究SIRT6在AngⅡ诱导足细胞胆固醇蓄积与损伤中的作用及机制。通过对AngⅡ输注动物模型、培养足细胞及足细胞病患者肾活检标本的研究，评价SIRT6表达与足细胞胆固醇蓄积和损伤的关系；通过SIRT6质粒转染、CRISPR/Cas9技术构建SIRT6敲除足细胞株以及应用特异性足细胞SIRT6基因敲除小鼠，探讨调控SIRT6表达对足细胞胆固醇蓄积与足细胞损伤的影响；通过药物调节细胞内胆固醇代谢，明确胆固醇蓄积对足细胞损伤的影响及机制。本研究将为足细胞病治疗的新靶点提供理论依据。

SIRT6是细胞胆固醇代谢的重要调节分子，其表达水平改变与足细胞损伤密切相关，但其调节机制仍不清楚。肾素血管紧张素系统（RAS）的异常激活是慢性肾脏病(CKD)发生和进展的重要危险因素，血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）是RAS的主要活性效应分子，本项目组前期发现AngⅡ可抑制SIRT6表达，导致足细胞胆固醇蓄积。本项目旨在探讨SIRT6在AngⅡ诱导足细胞胆固醇蓄积与损伤中的作用及分子机制。本研究发现AngⅡ刺激可显著减少大鼠肾小球及体外培养人足细胞中SIRT6的表达。胆固醇代谢方面，AngⅡ刺激可显著抑制ABCA1、ABCG1的表达，促进SREBP2、HMGCR、LDLR等的表达，导致足细胞胆固醇摄入、合成、流出调控失衡，最终引起足细胞胆固醇蓄积及损伤。应用甲基-β-环糊精（CD）促进足细胞胆固醇外流可显著改善AngⅡ诱导的足细胞胆固醇蓄积及损伤。通过对人足细胞系转染SIRT6全长质粒（pcDNA 3.1 SIRT6），同时给予AngⅡ刺激后发现：上调SIRT6表达可致SREBP2表达显著降低并部分改善AngⅡ诱导的足细胞胆固醇蓄积及凋亡，提示SIRT6通过影响SREBP2表达而参与足细胞胆固醇代谢的调节。为进一步明确SIRT6在足细胞胆固醇代谢中的作用，本研究成功构建特异性足细胞SIRT6基因敲除小鼠，研究发现：SIRT6敲除显著加重AngⅡ输注诱导的小鼠足细胞胆固醇蓄积及损伤，CD干预可改善AngII诱导的小鼠尿微量白蛋白肌酐比值（ACR）增高，促进胆固醇外流相关分子ABCG1表达从而减轻AngII诱导的小鼠足细胞胆固醇蓄积及损伤；SIRT6敲除可致足细胞ABCG1表达减少，从而减弱CD对AngII诱导足细胞胆固醇蓄积及损伤的保护作用。结论：SIRT6通过调控SREBP2/ABCG1表达参与足细胞胆固醇代谢调节，在RAS激活/AngⅡ刺激或足细胞病等病理条件下，SIRT6表达减少，足细胞胆固醇代谢失衡导致胞内胆固醇蓄积及足细胞损伤，CD可在SIRT6依赖下缓解AngII刺激引起的足细胞胆固醇蓄积及损伤。