微透析-液相色谱-纳米化学发光在线动态分析新技术应用于黄酮药动学的研究

中药药动学研究资料的缺乏是中药现代化的瓶颈问题之一，而生物样品中痕量药物的高通量、高灵敏分析技术是研究中药药动学的基本前提。本项目以分布广泛、疗效确切的黄酮类活性成分为研究模型，基于黄酮易于发生氧化还原反应产生化学发光，纳米粒子拟以能量接受体、氧化还原效应、催化效应、淬灭效应、富集效应、微反应平台等途径参与黄酮化学发光反应，提高化学发光效率，结合微透析技术的在体、实时采样特点，首次建立微透析－液相色谱－纳米化学发光（MD-HPLC-CL）在线联用新技术。利用该技术的高通量、高选择性、高灵敏度和宽线性范围等优点，克服黄酮药动学研究中常规采样法的耗时、干扰生命过程等问题，并解决生物样品干扰组分多、药物含量低、浓度变化范围大等分析技术难题，实现游离黄酮浓度的动态监测，研究黄酮体内吸收、分布及蛋白结合特征，为其更科学的新药设计和临床用药提供科学依据，并为其它中药活性成分的体内代谢过程研究提供借鉴。

生物样品中痕量药物的高通量、高灵敏分析技术是研究黄酮药动学的基本前提。本项目首次建立了一种新颖的在线纳米金催化鲁米诺－过氧化氢化学发光体系，该研究无需事先合成纳米金，而是巧妙地利用体系中碳酸盐缓冲液（鲁米诺介质）、过氧化氢（氧化剂）和氯金酸在线生成纳米金，从而提高化学发光效率。令人非常感兴趣的现象是：黄酮成分对本体系具有强烈的增强作用，而不是抑制作用。通过紫外－可见吸收光谱、化学发光光谱和透射电镜等测试，证明黄酮成分增强该化学发光的作用机制为：具有强还原性的黄酮与氯金酸混合后，立即生成大量的纳米金。由此开发了液相色谱－在线纳米金催化鲁米诺化学发光检测器，可同时对8种黄酮和酚类化合物进行高灵敏分析，其检测限为0.53～0.97 ng/mL (10.6～19.4 pg)。本法具有高选择性、高灵敏度和宽线性范围等优点，并与液相色谱的流动相具有良好的兼容性，可为开发其他在线纳米（金、银等）催化的化学发光检测器提供新思路。并以儿茶素和表儿茶素为黄酮成分研究模型，采用高通量的多位点微透析体内连续采样技术，血管和脑探针分别插入大鼠颈静脉和海马，探针植入平衡 2 h后，股静脉注射儿茶素和表儿茶素 (20.0 mg/kg BW)，收集微透析样品。血管探针对儿茶素和表儿茶素的体内平均回收率分别为 33.7%和 26.5%，脑探针的体内平均回收率分别为 38.3%和 29.1%。成功实现了大鼠血和脑药动学研究及其血脑屏障透过率评估，首次报道了儿茶素和表儿茶素的透过血脑屏障系数分别为 0.0726和0.1065，为其脑保护作用的物质基础提供一个有力的科学证据。本项目的研究成果在中药药动学研究领域将具有广阔的应用前景。