三种脂肽类抗生素影响解淀粉芽孢杆菌在水稻叶表面定殖的分子机制

Various bacillus amyloliquefaciens strains produced three kinds of lipopeptides, including surfactin, bacillomycin D and fengycin, which plays a key role in regulating plant colonization. In a previous study, we found that lipopeptides synthesis and biofilm formation genes of Bacillus amyloliquefaciens Lx-11 were significantly increased, which were induced by the rice leaf juice. Until now, little research focuses on bacillus amyloliquefacines strains colonized in rice phyllosphere. To explore the Mechanism of three kinds lipopeptides produced by bacillus amyloliquefaciens affected colonization in rice phyllosphere, a time-course of transcriptomic profiles of Bacillus amyloliquefaciens Lx-11 colonized in plant phyllosphere compare with lipopeptides mutant strains. The colonization related genes expression profiles were analyzed by means of whole-genome sequncing platforms and bioinformatics methods. The different expression genes related to colonization will be screened based on the genome sequence data. And RT-PCR method verified these gene expression levels. After that, some different key genes will be given investigation further by promoter analysis, gene knockout, functional complementation and overexpression methods, etc. Finally, we demonstrated that these key genes involved in Lx-11 strain colonization in rice phyllosphere and related pathways affecting lipopeptides synthesis and biofilm formation. In conclusion, results based on this proposal offer new strategies and clues to understand the mechanism of Bacillus amyloliquefaciens Lx-11 affected colonization in plant phyllosphere and provide some theory to improve the biocontrol efficacy.

Surfactin、bacillomycin D和fengycin是解淀粉芽孢杆菌分泌的三种重要的脂肽类抗生素，对解淀粉芽孢杆菌在植物上定殖有关键作用；研究发现在水稻诱导条件下，解淀粉芽孢杆菌Lx-11调控脂肽类和生物膜形成相关基因表达显著提高；但脂肽类抗生素影响解淀粉芽孢杆菌在水稻叶表面定殖的分子机制不清楚。基于此研究结果，本项目拟通过转录组分析Lx-11菌株和脂肽类抗生素合成缺失菌株在水稻叶表面定殖过程中的差异基因，结合Lx-11全基因组和生物信息学方法，筛选脂肽类抗生素调控Lx-11在水稻叶表面定殖的关键基因；并采用RT-PCR研究这些关键基因的表达特点；然后通过启动子分析、基因敲除、功能互补验证和过量表达等手段，阐明Lx-11与水稻叶表面定殖密切相关基因的功能。预期研究结果可为阐明解淀粉芽孢杆菌在水稻叶表定殖的分子机制提供新的思路和线索，同时为解淀粉芽孢杆菌的高效应用提供理论依据。

Surfactin、bacillomycin D和fengycin是解淀粉芽孢杆菌分泌的三种重要的脂肽类抗生素，对解淀粉芽孢杆菌在植物上定殖有关键作用；研究发现在水稻诱导条件下，解淀粉芽孢杆菌Lx-11调控脂肽类和生物膜形成相关基因表达显著提高；但脂肽类抗生素影响解淀粉芽孢杆菌在水稻叶表面定殖的分子机制不清楚。本项目通过转录组分析Lx-11菌株和脂肽类抗生素合成缺失菌株在水稻叶表面定殖过程中的差异基因，阐明Lx-11中与水稻叶表面定殖密切相关基因的功能。目前已初步建立生防菌Lx-11在水稻叶表定殖扩展相关差异表达基因数据库，数据分析显示：定殖初期 (喷施后6h)，Lx-11和surfactin突变体菌株中有1899个基因发生了差异表达，与野生型相比其中1791 (94.3％)个基因上调表达，108个基因(5.7％)下调表达；定殖早期(喷施后24h)与初期相比，仍旧有1978个基因发生了差异表达，其中1886个基因(95.3％)上调表达，92个基因(4.7%)下调表达。通过RT-PCR定量分析表明，EPS、TasA、Spo0A和Kin等基因表达显著提高，说明早期这些基因在生物膜形成过程中起着重要作用，也与水稻叶表的定殖密切相关。喷施生防菌Lx-11后水稻植株中防卫反应基因POX、PAL、LOX、PR10a、PR1a和PR4表达水平与清水对照相比都有不同程度的提高，其中POX、PR4和PR10a基因表达水平最大值分别是对照处理的9.06倍、5.35倍和9.25倍，这些基因可能参与寄主植株抵御病菌入侵过程中起着重要作用，与surfactin处理相比，生防菌提取的Lipopeptides物质同样可以诱导植株防卫基因和防御酶活性提高，表明Lipopeptides在诱导植株产生ISR中起着重要作用。生防菌活菌数是影响使用效果的最主要因素之一，因此在生产芽胞杆菌活菌制剂的过程中芽孢形成率是一个重要指标，芽孢形成率达到90%左右是发酵完成的标准。通过对解淀粉芽孢杆菌Lx-11发酵过程的动态观察，表明Lx-11菌株在二级罐中发酵16 h左右含菌量达到高峰（1.7×1010 cfu/mL），在18 h芽孢形成率达到90%以上，放罐时将发酵菌液的pH值调整为6.0左右，同时添加1‰山梨酸钾，这些技术措施可以确保半年后常温储存的解淀粉芽胞杆菌Lx-11发酵液活菌数保持相对稳定。