杀线虫芽孢杆菌在宿主肠道定殖及相关分子机制的研究

以线虫Caenorhabditis elegans为模式，研究病原细菌与宿主间相互关系一直是生命科学研究中的重要问题，病原细菌如何在宿主体内定殖是目前该领域研究的焦点。本项目在前期发现杀线虫芽孢杆菌B16通过吸引线虫吞食进入肠道定殖并分泌蛋白酶杀死线虫新机制的基础上，采用荧光蛋白标记、激光共聚焦观察、突变文库筛选、比较分析、基因敲除及功能互补验证等方法，找到杀线虫芽孢杆菌在线虫肠道定殖的关键基因和蛋白，并确定其在定殖过程中的功能，从分子层面探索杀线虫芽孢杆菌侵染线虫过程中的相互作用，为研究病原细菌在宿主肠道定殖的分子机制提供一个新的模型。研究结果将拓展人们对病原细菌致病机制的认识，为减少病原细菌感染性疾病的发生或提高病原微生物对宿主的生防效果等提供理论基础。

我们前期对杀线虫芽孢杆菌(Bacillus nematocida B16)的研究工作发现，该病原细菌进入线虫肠道，依靠毒力蛋白酶破坏宿主肠道结构与功能导致宿主死亡，建立从“内”到“外”的侵染途径。在此基础上本研究构建了杀线虫芽孢杆菌B16菌株的绿色荧光蛋白组成型表达突变株B16g，侵染跟踪获得了杀线虫芽孢杆菌B16在宿主肠道定殖的直接证据，并建立了测定B16g定殖能力的定性、定量模型。进而构建了杀线虫芽孢杆菌的随机突变文库，获得约5103个转化子，从中筛选出31株丧失或减弱在线虫体内定殖能力的转化子，共得到杀线虫芽孢杆菌在线虫体内定殖的过程中起重要作用的22个潜在调控基因，将这些基因依据功能大概归为以下8类：芽孢形成基因，芽孢萌发基因，黏附相关基因，生物膜形成相关基因，趋化运动相关基因，宿主免疫相关基因，调控基因以及功能未知基因。将芽孢形成相关基因spo0A、芽孢萌发基因gerD、胶原蛋白基因adp分别敲除后，发现突变株Δspo0A和ΔgerD定殖能力均显著下降，而且Δspo0A菌株不能形成芽孢，48h线虫死亡率降低84%；ΔgerD菌株芽孢不能萌发，48h线虫致死率降低69%。Δadp菌株粘性减弱，蛋白酶活性与野生型菌株无显著差异，但定殖能力与线虫致死率均比野生菌株显著降低。将以上三个基因分别通过回补突变后，各检测指标基本与野生型菌株一致。根据已有结果，杀线虫芽孢杆菌形成芽孢，芽孢进入肠道并萌发，黏附于肠道的特定位点而成功定殖。从而确定了杀线虫芽孢杆菌在定殖宿主过程中的关键基因和蛋白，揭示了其在宿主肠道定殖的分子机制。该研究内容已经正式发表SCI论文5篇，已接受1篇，另有2篇SCI论文仍在投稿中，正式发表中文核心期刊2篇，同时申请国家发明专利2项，培养硕士研究生2名。申请人获得河南省教育厅学术技术带头人，并被评为“南阳师范学院卧龙学者”，完成了既定目标。本课题的研究对今后深入探索杀线虫芽孢杆菌在线虫肠道与宿主内生菌的互作机制奠定了良好的基础。