铜绿假单胞菌与嗜麦芽寡养单胞菌在共同感染中的互作机制研究

Pseudomonas aeruginosa and Stenotrophomonas maltophilia are multidrug resistant bacterial pathogens which are listed in the top five clinical isolates causing respiratory infections in recent years. Few studies reported that clinical co-infection caused by the two pathogens increased mortality, however, the underlying mechanism remains unknown. Our previous results revealed some interactions between these two species: S. maltophilia supernatant increased the antibiotic resistance of P. aeruginosa; nonmotile S. maltophilia could swarm on agar plate with the presence of P. aeruginosa, while the motility of P. aeruginosa was inhibited by S. maltophilia and its quorum sensing signal DSF; P. aeruginosa supernatant restored the DSF deficient mutant morphology change of S. maltophilia. Based on our preliminary study, multi-omics techniques will be performed to systematically study the interspecies interactions between P. aeruginosa and S. maltophilia during co-infection at multi levels. Then these detected interspecies interactions will be verified in clinical isolates causing co-infection using real time q-PCR and metabolites quantitative analysis. Key genes involved in core interaction pathways will be knocked out to construct null mutants to demonstrate their roles. These derived strains and related metabolites will be further tested in vivo. With these data, we could identify a realistic interaction mode between P. aeruginosa and S. maltophilia during co-infections and understand the underlying molecular mechanism of increased mortality. Interspecies crosstalk and other interaction pathways during PA-SM co-infection may provide novel targets and strategies for the clinical intervention and treatment.

铜绿假单胞菌(PA)和嗜麦芽寡养单胞菌(SM)都是近年来呼吸道感染中检出率排名前五的多重耐药革兰氏阴性细菌。临床数据显示两种致病菌的共感染会导致患者死亡率升高，然而其机制尚不明确。本课题组前期研究发现两菌间存在互作关系：SM上清液可提高PA的抗生素抗性，SM及其群体感应信号分子可抑制PA的运动性；PA能互补SM因群体感应信号缺失而导致的细胞表型变化，且协助不动的SM获得运动性等。在此基础上，本项目拟整合转录组和代谢组等多组学技术手段，展开多维度分析以挖掘两种病原菌间相互作用机制；再利用RT-qPCR和特定代谢产物产量分析等方法，在共感染临床菌株中验证这些互作机制；基于实验结果，构建互作通路中关键基因的突变株，进行小鼠活体接种试验，以明确两种病原菌在共感染中的真实互作模式，并解析其共感染导致致病性增强的分子机制。本项目的研究结果将为PA-SM临床共感染的干预与治疗提供新思路和新策略。

铜绿假单胞菌(PA)和嗜麦芽寡养单胞菌(SM)都是近年来呼吸道感染中检出率排名前五的多重耐药革兰氏阴性细菌。临床数据显示两种致病菌的共感染会导致患者死亡率升高，然而其机制尚不明确。本课题组前期研究发现SM是少数在于PA共存时未被PA大面积杀死的细菌，且两菌间存在PA携带SM共同泳动的迁移现象。经构建PA泳动相关因素缺失突变体携带SM泳动试验证实，PA通过四型菌毛物理黏附SM实现共同迁移。在此基础上，本项目拟整合转录组和代谢组等多组学技术手段，展开多维度分析以挖掘两种病原菌间相互作用机制。项目实际执行过程中经过更换外源信号刺激方式、梯度测试CFU与测序获得reads数比值间关系等摸索后，两轮转录组测序结果证实PA于SM间在转录水平上没有显著的互作信号通路。本项目按照计划构建PA的CDA缺失突变体，构建SM的DSF缺失突变体，并通过试验和转录组探索两种细菌的潜在互作关系。项目经研究发现，生物膜形成能力、重要致病因子的含量检测以及转录组测序等试验数据证实CDA信号对PA的致病性没有显著影响。且PA于SM共同感染巨噬细胞获得的细胞死亡率和存活率均与PA单独侵染细胞水平相似，得出结论为PA与SM共感染并未进一步增强细胞毒性的结果，与项目最初设计的调研背景信息不符。. 基于前期实验结果，SM具有抵抗PA杀死作用的免疫机制结论成立。故本项目后调整研究方法，利用转座子随机插入标准菌株SM的途径，构建了一个多达百万级数量的突变体菌株库，基因组覆盖率达到基因数量200倍以上。并通过多次技术探索，成功构建Tn-seq测序文库，在SM基因组中鉴定到抵抗PA杀死作用的免疫机制相关基因202个，正在分析验证从中提炼的关键通路信息，为PA-SM临床共感染的干预与治疗提供新思路和新策略。. 另外，本项目在针对最后一线抗生素的耐药性机制研究方面也做了部分工作，鉴定了新型替加环素耐药基因tet(X14)，并对tet(X)家族基因的分布与水平转移情况做了全面分析，为防控替加环素耐药性传播提供理论依据。