新水稻57H突变基因的定位克隆与机能解析

Glutelins and prolamins are synthesized in the ER and accumulated into the vacuolar PB in endosperm cell of the wild type rice. The 57H mutations causing the high increase of 57kD glutelin precursor and the remarkable decrease of mature glutelins have been involed in accumulation of storage proteins. In the preliminary study, we have obtained a novel 57H mutant(GPH1) that showed both the glutelin precursor increase and the lack of 13kDa prolamin but not the mature glutelin decrease, found 57H character in GPH1 to result from a novel non-allelic 57H monogenic mutation with dosage effect on the glutelin precursor increase, and completed the initial location of the mutant gene in GPH1. In this research project, we are palnning to carry out the following works to seek the unknown genetic information for synthesis of storage proteins in rice. Isolation and identification of the mutant gene will be performed using methods for positional cloning, genetic complementation, followed by understanding of its mutation mechanism adopting cDNA sequencing, southern-blotting techiques. Analysis of transcriptional pattern of the gene, and characterization, identification and subcellular localization of protein encoded by the gene will be performed to reveal information for its function, using RT-PCR, recombinant DNA, proteomic, immunoblotting, fluorescent-microscopic techniques. To explore mechanism concerning effect of the mutation on synthesis and accumulation of storage proteins in rice endosperm, alteration of molecular composition and subcellular accumulation state of storage proteins in GPH1 endosperm will be analyzed using 2D electrophoretic, mass spectrometric and immunocytochemical methods.

野生型水稻中，谷蛋白与醇溶蛋白在胚乳细胞内质网被合成后，分别蓄积成亚细胞形态不同的蛋白体。导致57kD谷蛋白前体高量增加、成熟谷蛋白显著减少的隐形57H变异被表明是调控储藏蛋白蓄积的基因突变。前期研究获得成熟谷蛋白不减少、兼具13kD醇溶蛋白缺失性状的新型57H突变体(GPH1)，发现GPH1性状起因于对谷蛋白前体增加有剂量效应的新基因突变，并对其进行了初步定位。为了探求关于水稻胚乳储藏蛋白质合成的未知遗传信息，本研究拟采用基于分子标记的图位克隆、功能互补试验等方法，进行GPH1突变基因的分离与鉴定，阐明其变异机理；采用定量RT-PCR、重组DNA、蛋白组学、免疫印迹、荧光显微等技术，解析该基因的转录模式，对其蛋白质产物进行表征、鉴定与亚细胞定位；采用双向电泳、质谱、免疫细胞化学等方法，解析GPH1储藏蛋白质的分子构成与亚细胞蓄积状态的变化，探究该基因对水稻储藏蛋白质合成与蓄积的影响机制。

醇溶蛋白和谷蛋白是主要的水稻胚乳储藏蛋白质。在野生型水稻胚乳胚乳中，醇溶蛋白和谷蛋白多肽链分别被定位于不同粗面内质网亚区域（PB-ER和C-ER）的mRNA编码合成后，经过不同的亚细胞区室化途径最终蓄积成球状的内质网衍生型蛋白体（PB-I）和不规则的液泡型蛋白体（PB-II）。导致57kD谷蛋白前体高量增加、成熟型谷蛋白显著减少的5个隐性基因突变（57H）已被表明参与水稻胚乳储藏蛋白质的翻译后区室化。本研究从490份水稻种质资源中获得谷蛋白前体大量生成的新型突变体系列（GPGG1、GPGG2、GPGG3），并进行了所得突变体的生化性状表征、遗传学鉴定与与免疫细胞化学解析。生化性状表征结果显示，与野生型水稻品种（辽盐6号）相比，GPGG系列并未减少成熟型谷蛋白，其中GPGG1与GPGG2兼具13kD醇溶蛋白缺失性状。遗传分析结果显示，这些GPGG变异是非等位于已报道57H变异的基因突变，其中GPGG3变异是显性突变，而GPGG1与GPGG2变异是位于12号染色体短臂的等位突变且对谷蛋白前体的生成具有剂量效应。电子显微观察显示了在GPGG1胚乳细胞中簇状的复合ER(CER)、复合PB(CPB)、内侧高尔基囊/反式高尔基网络(MGS/TGN)、MGS/TGN转运型小泡、TGN连通型蛋白储藏液泡(PSV)、PSV蓄积型PB、中央大液泡(LCV)和LCV降解型PB结构体系的存在。使用抗14kD醇溶蛋白抗体和抗谷蛋白抗体的免疫显微观察显示了GPGG1胚乳细胞中的CPB构造由醇溶蛋白球状体和谷蛋白前体球状体结合而成、而PSV-deposited PB由成熟的谷蛋白组分蓄积而成。使用抗谷蛋白抗体和抗ER标记蛋白(Bip)抗体的免疫荧显观察明确了CER应答了PGG1胚乳细胞中储藏蛋白质的合成。这些结果指出GPGG基因参与水稻储藏蛋白质的合成，其变异诱导了胚乳细胞中新的储藏蛋白质区室化通路的出现。本研究取得的进展对于阐明水稻胚乳储藏蛋白合成的遗传调控机制具有开创性意义。