水稻新卷叶基因OsCLD1的克隆与分子调控机制解析

Leaves are the most important photosynthetic organs of cereal crops. Their morphologies and spatial positions which could affect plant architecture and light utilization are therefore the key traits in regulating grain yields. Rolling leaf is not only an important model system for the research of leaf development and establishment of leaf adaxial-abaxial polarity but also considered an important index of ideal plant architecture for many rice breeders. So, it is a useful and interesting phenotype in rice. Previously, our morphological, genetic and molecular analyses have indicated that the oscld1 is a novel rice rolling/curling leaf mutant, and its causing gene, OsCLD1, is also a new gene of function unknown. Based on these results, we propose to study the fine mapping, map-based cloning, expression patterns and protein subcellular location of OsCLD1. Also，overexpression and RNA interference of OsCLD1 gene will be conducted in transgenic plants to confirm the gene function. Furthermore, whole-genome gene expression profiles will be investigated in oscld1 mutant by rice genome microarray to clarify the key genes or pathways regulated by OsCLD1. In sum, our molecular elucidation of OsCLD1 will have theoretical implications for utilizing of rolling leaf traits in rice breeding as well as understanding of molecular mechanisms of leaf morphogenesis and establishment of leaf adaxial-abaxial polarity.

叶是禾谷类作物最重要的光合器官，其形态与空间分布决定植株株型并影响植株受光姿态，进而直接影响作物产量。卷叶性状不仅是研究植物叶形态发育与极性建成的模式系统，适度的卷叶还是水稻理想株型模式的重要指标，在理论研究和育种应用中都具有重要价值。我们前期研究已证实，oscld1是一个表型独特的水稻新卷叶突变体，且其控制基因OsCLD1是一个新的水稻卷叶基因。本项目拟在此基础上，通过oscld1突变体表型与细胞学研究，重点进行OsCLD1基因精细定位、图位克隆、表达模式和亚细胞定位分析，并利用转基因分析OsCLD1基因过量表达及沉默对植株形态的影响，明确OsCLD1基因的生物学功能。同时，利用基因芯片分析突变体全基因表达谱，明确其调控相关关键基因，进而阐明OsCLD1基因调控叶卷曲的分子遗传机制。本项目研究结果对卷叶性状的育种利用以及叶形态发育与极性建成调控机理的阐明具有重要理论意义。

水稻卷叶有助于叶片挺直从而改善植株的通风和透光，因此适度的卷叶表型是水稻理想株型的一个重要指标，并在水稻高产育种中具有重要利用价值。我们利用籼稻93-11经γ射线诱变获得一个表型十分突出的卷叶矮化突变体cld1，其叶片严重内卷且皱缩扭曲。图位克隆研究表明，在cld1突变体中CLD1基因的功能缺失并非DNA序列突变所致，而归咎于蛋白编码区中游区域DNA甲基化水平改变引起目的基因的表达完全沉默，进而导致cld1突变体的极端表型。CLD1的功能通过RNAi、T-DNA突变体和等位性测验等表型分析得到验证。CLD1编码一个GPI锚定蛋白，并与水稻SRL1基因等位。GFP亚细胞定位表明CLD1蛋白定位于水稻细胞质膜。启动子活性分析和qRT-PCR分析均表明CLD1在水稻各发育时期不同组织中均保持较高表达水平，但其表达可受氧化和干旱胁迫的强烈抑制。组织学切片分析表明cld1突变体叶片泡状细胞数目并未发生明显变化，但泡状细胞的形态发生了明显的皱缩,且叶片表皮细胞有明显的泡状化趋势；ESEM（环境扫描电镜）观察发现cld1突变体叶片表皮硅质化程度显著降低。总之，CLD1基因的超表达并未导致叶片形态异常，但组织学切片观察发现其叶片泡状细胞的充盈度明显高于对照。同野生型相比，cld1突变体叶片相对含水量显著降低，而离体叶片失水速率显著升高，且cld1突变体对干旱胁迫的抗性显著减弱；光合作用测定也显示cld1突变体叶片蒸腾速率明显高于野生型。上述结果综合表明导致cld1卷叶表型的主要原因是由于叶片表皮细胞泡状化引起叶片水分散失过快从而导致叶片的皱缩卷曲。此外，我们利用iTRAQ蛋白质组学技术对cld1突变体的差异表达蛋白进行了定量分析，并鉴定到多个与细胞渗透调节相关基因。综上，我们认为CLD1基因的功能主要在于维持叶片表皮的完整性，进而调节叶片水分平衡。