棉花抗坏血酸氧化酶催化的质外体氧化信号累积参与纤维伸长发育的作用机制研究

Oxidative signal accumulation in the apoplast plays an important role in cell elongation development. Ascorbate oxidase (AO) can produce a similar effect of oxygen burst by oxidizing reduced ascorbate acid in the apoplast, and is the key factor determining the apoplast oxidation state. However, no related research results were reported in cotton fiber development. In our previous study, we cloned a apoplastic GhAO gene, GhAO was localized in cell wall, the expression of cotton apoplastic GhAO was closely interrelated with cotton fiber elongation development, and overexpression of GhAO gene could promote cell elongation of cultured BY2 cells significantly. Based on the research results, the purpose of this project is to elucidate the molecular mechanism of apoplast oxidative signal accumulation catalyzed by ascorbate oxidase involving in fiber elongation development. In this study, following research works will be performed: to clone apoplast localized GhAO genes and their promoter sequences; to study the promoter feature and function of cis-acting element participating in auxin response; to analyze GhAO expression profiles during fiber development stages; to investigate GhAO functions in cell elongation development via Arabidopsis T-DNA insertion mutants; to research expression characteristics and signal transduction regulation of GhAO resopnding to auxin through in vitro treatment of IAA or NPA; Using mutant and overexpression GhAO Arabidopsis plants as subjects to study changes of intracellular apoplast redox status and alterations of cell wall; utilizing transgenic cotton to explore GhAO functions in regulating cotton fiber development. This study will provide the foundations for fiber development mechanism elucidation and premium quality cotton breeding.

质外体中氧化信号累积在细胞伸长发育中发挥重要作用。抗坏血酸氧化酶AO能够氧化质外体中的抗坏血酸产生类似氧化爆发的作用，是决定质外体氧化状态的关键因子。相关研究在棉纤维发育中鲜有报道。我们前期研究中克隆得到一个棉花质外体GhAO基因，GhAO定位于细胞壁，该基因的表达与纤维伸长发育密切相关，过表达GhAO显著促进烟草细胞的伸长。在此基础上，本项目旨在研究GhAO催化的质外体氧化信号累积参与纤维发育的作用机制。拟开展如下工作：克隆GhAO基因及其启动子，分析启动子的特征和响应生长素元件的功能，分析GhAO参与纤维发育的表达特征；利用拟南芥突变体验证GhAO参与细胞发育的功能；外源施加生长素或其抑制剂分析GhAO参与生长素的表达特征和信号转导调控；在拟南芥中改变GhAO的表达分析细胞壁变化；转基因棉花研究GhAO参与纤维发育的功能；为棉纤维发育机制解析和优质棉花新材料培育提供参考。

一、项目背景. 质外体是连接从外界环境到细胞内的桥梁，能够作为受体感受外界环境的代谢信息，在细胞生长、信号转导等方面发挥着关键作用。抗坏血酸是质外体中唯一的可变的抗氧化缓冲物质，抗坏血酸氧化酶（AO）决定质外体氧化信号的唯一关键酶，可以通过氧化抗坏血酸进而调控质外体的氧化/还原状态，进而影响植物细胞感受并传导外界变化和启动激素信号转导途径枢纽。本项目拟主要展AO及其催化的质外体氧化参与细胞伸长发育的机制研究，本项目研究结果对于棉纤维发育分子机制解析及进一步利用基因工程技术培育优质的棉花新材料具有重要的理论研究意义和潜在的生产应用价值。. 二、主要研究内容. 主要开展五方面的内容：GhAO基因的筛选、克隆及表达特征分析；GhAO基因参与细胞发育的功能验证；GhAO响应生长素介导的信号转导调控分析；GhAO影响细胞壁变化的功能分析；转基因棉花研究GhAO基因参与纤维伸长发育的功能。. 三、重要结果. 1. 棉花AO家族基因的鉴定和特征分析。. 鉴定获得了8个GhAO基因，并对他们的染色体定位、基因结构、保守的酶催化结构域、进化等进行了广泛地生物信息学分析；GhAO1A、GhAO1D在纤维发育起始期表达两十分显著，此外在根、茎、花瓣组织中具有较高的表达，暗示了这2个基因可能在纤维发育及组织器官发育中发挥着重要作用。. 2. GhAO1D促进烟草悬浮细胞伸长发育。.GhAO1D基因在棉纤维发育时期显著表达；在烟草BY-2悬浮细胞中过量表达GhAO1D显著促进了细胞的伸长发育。GhAO1D可能通过其启动子中包含的生长素响应元件受生长素的调控进而影响细胞的氧化还原状态及钙离子通道基因的表达，进一步促进细胞伸长发育。. 3. GhAO1A调控植物开花发育。. GhAO1A在花组织中显著表达，并在暗处理后的光恢复过程中表现出迅速的响应变化。GhAO1A可能通过影响细胞对活性氧的敏感度、开花基因的表达等进而调控植物的开花过程。. 4. 棉花的遗传转化。. 构建E6-GhAO1D过量表达载体，通过农杆菌介导的花粉管通道法转化陆地棉新陆早33号。经筛选鉴定后的转基因棉花材料的纤维长度获得了显著的提升。