萘霉素的生物合成及相关重要蛋白的功能研究

萘霉素属于大环内酰胺类化合物，是一类具有较大安莎环的安莎类抗生素。与其它萘安莎类抗生素抑制RNA聚合酶的活性不同，萘霉素同时具有抗细菌、抗真菌和抗肿瘤活性。迄今为止，对萘霉素的生物合成机理及其相关重要蛋白的研究还未深入开展。.前期工作中，我们从美登木内生菌Streptomyces sp. CS中分离到了多种萘霉素组分，并以AHBA合酶基因为探针，从该菌株的基因组文库中克隆到了部分萘霉素生物合成基因。在此基础上，我们将应用染色体步移测序的方法获得完整的萘霉素生物合成基因簇，并结合体内体外的相关实验，通过遗传学、生物化学和化学分析等方法，对萘霉素生物合成中萘环的形成机制、后修饰中氯代的机理等进行系统研究，揭示萘霉素生物合成基因簇中相关重要蛋白的功能和催化特征，阐明其生物合成机制，同时为利用其它安莎类化合物的基因对萘霉素进行改造，获得具有良好活性的新衍生物奠定基础。

萘霉素是一类29元环的安莎内酰胺类抗生素，具有抗菌和抗肿瘤活性。这类化合物生物合成的起始单元为3-氨基-5-羟基苯甲酸（AHBA）。为研究萘霉素的生物合成过程及其相关重要蛋白的功能，本项目建立了萘霉素产生菌Streptomyces sp. CS的基因组DNA文库，利用AHBA合成酶基因作为探针对文库进行筛选和测序，共得到106 kb的连续序列。大片段缺失的结果说明该序列与萘霉素的合成相关。这个生物合成基因簇共有32个开放阅读框，包含了所有萘霉素合成所需的结构基因和后修饰基因，以及一些与转录调控和运输相关的基因。对其中预测编码氯代酶的基因nat1进行突变，确定其编码的蛋白Nat1负责萘霉素含氯组分30位碳上的氯代反应。将nat1和另一类安莎类化合物ansamitocin中负责氯代的asm12基因进行体内交互回补实验，结果显示这两个基因可以相互回补，证明它们具有相似的体内催化机制。对生物合成基因簇中另一个预测与萘环形成相关的基因nat2进行突变后，产物中检测不到任何萘霉素组分，仅有少量的4酮中间产物desacetyl-SY4b，提示其编码的Nat2为萘霉素萘环形成过程中的关键蛋白。. 在获得以上研究结果的基础上，我们利用AHBA合成酶基因对实验室的菌种库进行了资源挖掘，从700株放线菌中筛选得到24株具有产生AHBA衍生物潜力的阳性菌株。在确定菌株的种属过程中，发现并鉴定了3个稀有放线菌新种，分别为野野村属、韩国生工属、拟孢囊属的菌株。此外，以该基因作为探针，我们还从另一株产生安莎类化合物曲张链菌素的壮观链霉菌NRRL2494中获得了91.5 kb的曲张链菌素生物合成基因簇，并成功建立了该菌株的遗传操作体系。目前，对曲张链菌素后修饰过程中3个甲基转移酶Sva7、Sva14和Sva15的功能研究正在进行中。