微管紊乱介导的信号通路在PUMA化疗增敏顺铂耐药卵巢癌细胞中的作用

Cisplatin is one of the most widely used chemotherapeutic agents in the treatment of ovarian cancer. However, the development of cisplatin resistance limited its efficacy. We first reported that the p53 up-regulated modulator of apoptosis(PUMA)chemosensitized intrinsically resistant SKOV3 ovarian cancer cells to cisplatin by inducing apoptosis and by lowering the threshold set by Bcl-xL and Mcl-1. We further found that, in SKOV3 cells, overexpression of PUMA caused microtubular disarray, G2/M arrest, anoikis and downregulation of AKT phosphorylation. Based on these observations, we speculate that PUMA chemosensitizes cisplatin-resistant ovarian cancer cells to cisplatin by inducing apoptosis and anoikis, and by lowering the drug-resistant threshold (down-regulation of AKT phosphorylation and Bcl-xL and Mcl-1,etc). Although a previous report suggested that overexpression of PUMA caused microtubular disarray in colon cancer cells, few report showed that it could induce anoikis. Furthermore, the action mechanism of AKT phosphorylation downregulated by PUMA remains unclear. In the current study, we will reveal the intrinsic link among PUMA-induced microtubular disarray,its induction of apoptosis and anoikis and downregulation of the drug-resistant threshold by integrating use of various experimental techniques. We will also clarify the role of microtubular disarray-mediated signaling pathway in chemosensitization of cisplatin -resistant ovarian cancer cells to cisplatin by PUMA. This project will provide the theoretical basis for the treatment of ovarian cancer.

顺铂是卵巢癌治疗的首选药物，但耐药性限制了其疗效。我们首次报道，p53上调的凋亡调控分子(PUMA)通过促凋亡、降低Bcl-xL与Mcl-1设置的门槛而对顺铂耐药的SKOV3卵巢癌细胞起化疗增敏作用。进一步研究发现，PUMA过表达引起SKOV3细胞微管紊乱、G2/M期阻滞,诱导anoikis并降低AKT磷酸化水平。由此，我们推测PUMA通过促凋亡、降低耐药门槛(降低AKT磷酸化水平、下调Bcl-xL与Mcl-1等)及诱导anoikis起增敏作用。尽管有PUMA引起结肠癌细胞微管紊乱的类似文献，但其诱导anoikis则鲜有报道，且PUMA降低AKT磷酸化水平的机制也不清楚。本项目中，我们将综合使用各种实验技术揭示PUMA引起的微管紊乱与其促凋亡、降低耐药门槛及诱导anoikis之间的内在联系, 阐明微管紊乱介导的信号通路在PUMA增敏顺铂耐药卵巢癌细胞中的作用,从而为治疗卵巢癌提供理论基础。

顺铂是卵巢癌治疗的首选药物，但耐药性限制了其疗效。尽管关于PUMA诱导凋亡已经有大量研究，但这些研究集中在PUMA通过线粒体失能介导的凋亡途径而发挥作用。本项目主要围绕微管紊乱介导的信号通路阐明PUMA增敏顺铂耐药卵巢癌细胞的机制。本项目取得一些新的发现，(一). 微管干扰及其引起的抗肿瘤作用：(1). PUMA基因转染或腺病毒(Ad-PUMA)感染均导致A2780s与SKOV3卵巢癌细胞出现微管紊乱与G2/M 期阻滞; (2).PUMA一方面抑制RSK2激酶的活性，后者进一步抑制stathmin的磷酸化；另一方面导致RSK2与stathmin的相互作用减弱, 从而使stasthmin发生蛋白酶体介导的降解，从而诱导细胞微管紊乱；(3) PUMA激活ASK1-JNK、ASK1-p38通路， p38进一步磷酸化paxillin而破坏细胞黏着斑结构；细胞凋亡过程中激活的caspase裂解FAK，二者共同促进anoikis的发生。（二）ROS导致的DNA损伤应答及其在PUMA诱导凋亡中的作用：(1). Ad-PUMA感染卵巢癌细胞后, 外源性的PUMA主要定位于线粒体上、少数积累在细胞质里，细胞继而发生线粒体失能介导的凋亡; (2). Ad-PUMA感染卵巢癌细胞后，细胞产生ROS。该ROS的产生是通过功能性的BAX而实现的，ROS的产生并不激活ROS生成相关的酶；该ROS的产生与caspase激活与否无关，也不依赖于细胞的P53状态；(3). 该ROS的产生随后激活了Nrf2/HO-1途径，并导致细胞DNA损伤，继而发生DNA损伤应答。(4). 在DNA损伤应答过程中，ATM、ATR、DNA-PKcs、Chk1、Chk2等激酶被激活, 且与PUMA诱导的凋亡有关； (5). ROS激活的JNK在DNA损伤应答与凋亡中发挥双重作用；（三）PUMA对顺铂耐药细胞增敏作用的新机制：(1) PUMA激活的JNK使BCL2发生磷酸化，促进caspase级联反应，并使PP2A磷酸酶活化而导致AKT去磷酸化，从而对顺铂耐药的细胞起增敏作用；(2). PUMA将DNA-PK等DNA修复蛋白阻滞于细胞质中而影响DNA修复功能，从而对依托泊苷与顺铂等DNA损伤类化疗药起增敏作用。我们的研究初步阐明了微管紊乱介导的信号通路在PUMA 增敏顺铂耐药卵巢癌细胞中的作用。