大连海域海洋放线菌的多样性及其功能菌株的筛选

大连地处黄渤海和冷暖水交界带，具有中国最冷和交换能力最强以及季节温差大的海域特征，其中孕育着不同于其他海域种群特点和具有独特代谢途径的海洋放线菌，是获得新型放线菌和放线菌代谢产物的重要资源。本项目将于大连市政府规划的10个一类海洋功能区进行样品的采集，建立海洋放线菌的分离纯化方法，分离获得大量海洋放线菌。同时以各种海洋环境中生物基因组总DNA为模板，采用PCR-DGGE技术,分析不同海洋功能区样品的KS(酮基合酶)基因和16S rRNA基因的多样性，阐明不同海洋功能区中放线菌资源的分布特点，并预测其中可能存在的新型放线菌，以及具有产生新型聚酮类化合物潜能的功能性放线菌，通过对其培养基和培养条件的优化，建立快速准确地筛选功能性放线菌的方法，进而开展功能性放线菌的发酵条件优化及新型聚酮类化合物的分离纯化等研究，为获得具有自主知识产权的新农药或新药物以及海洋生态环境评价系统的进一步完善奠定基础。

本课题组严格按照项目申请书中的研究计划（研究目标、研究内容、年度安排）开展相应的研究工作。项目组分别于2010-2013年连续四年在大市政府规划的不同海洋功能区采集样品245份，包括海洋沉积物样品和海洋生物样品。建立了海洋放线菌分离纯化方法，进行了不同海洋样品中生物基因组DNA提取方法和进行海洋放线菌多样性分析的PCR-DGGE技术条件的优化。项目组共分离获得759株海洋放线菌，其中，对瓜类枯萎病具有拮抗活性的菌株31株，对金黄色葡萄球菌具有活性的菌株357株，对大肠杆菌具有活性的菌株163株，新种4个，分别为Streptomyces yaluensis sp. nov. S601，Croceicoccus yaluensis sp. nov. S602，Agromyces yaluensis sp. nov. S603，Nocardia yaluensis sp. nov. S604。筛选的菌株中，进行菌株专利保藏4个，专利菌株及其保藏号分别为Streptomyces SP. V601 (CGMCC No.8582), Vibrio crassostreae (CGMCC No.8584), Pseudoalteromonas mariniglutinosa (CGMCC No.8583), Streptomyces griseoplanus (CGMCC No.8185)。海洋放线菌多样性分析结果显示，在各样品中，γ-Proteobacteria 和 Bacteroidetes细菌为优势菌群，在各个样品中都有分布。放线菌门中的放线菌目、拟无枝菌酸菌、小单孢菌科、伪诺卡氏菌属、链霉菌科、链孢子囊菌科、高温单孢菌科在各样品中均有分布。利用响应面法对部分获得的海洋功能菌株进行发酵条件的优化。项目组利用从大连海域沉积物中分离筛选的对黄瓜枯萎病病原菌具有较好拮抗作用的链霉菌菌株GQ17、YH91及对细菌有较好拮抗活性的链霉菌菌株YH23和YH6组成的拮抗链霉菌组合ACT-1和ACT-2，开展其对黄瓜枯萎病的防治研究。同时，采用PCR-DGGE技术分析了施入2个链霉菌混合菌液组合后发病、健康及对照发病、健康共6个样品的根际土壤细菌多样性。结果显示，拮抗链霉菌组合ACT-1和ACT-2对黄瓜枯萎病的防治效果均明显高于生物农药-申嗪霉素，其防效分别为57.15%和42.85%。