单分子光镊方法解析RSC核心复合物的核小体驱除机制及SWI/SNF重要亚基的基因调控作用

ATP-dependent chromatin remodelers modulate gene expression through dynamically altering nucleosome structures. As a super regulator for gene expression and regulation, the mutations in the subunits of remodelers are closely linked to many disease syndromes, including cancers. Revealing the real dynamics and therefore the molecular mechanisms of chromatin remodeling are the direct key for pathology of chromatin-related diseases. Based on my previous studies, I will employ the high-resolution optical tweezers to investigate the remodeling mechanism of ATPase core complex of RSC, with the emphasis on how the remodelers reject histones from nucleosomal DNA. A specially labeled reconstituted nucleosomal DNA which constituted of 3 individual nucleosomes will be utilized as the working templates for RSC core complexes in our single-molecule optical tweezers experiments. Combining with biochemical strategies, like inserting fusion anchors or restriction sites, single molecular experiments will allow us to dissect the rejection mechanisms of nucleosomes. Furthermore, we will explore the fundamental machinery for chromatin remodeling，regulation effects of Histone modification and the roles of the key subunits in SWI/SNF family, like brg1, snf5 etc.

染色质重塑蛋白复合物利用ATP水解能改变染色质结构调控基因的表达。作为细胞中基因表达的超级调控者，其亚基的突变与诸多疾病，包括癌症有着紧密的联系。在表观遗传学迅速发展的今天，还原生物分子相互作用的动态过程，探究基因表达调控的分子机制，进而揭示突变亚基致病机理是本领域研究的前沿课题之一。以前期工作为基础，本项目将利用高精度双光镊单分子技术研究染色质重塑蛋白RSC核心ATPase复合物的核小体驱除分子机制。拟以核小体DNA为模板，实时地追踪单个RSC复合物在核小体表面卷起DNA Loop及移位的动态过程。运用标记免疫标签、插入Anchor及酶切位点等方法，制备有三个核小体DNA特殊模板，巧妙地解析RSC复合物驱除核小体的分子机理。以此为切入点，深入地剖析染色质重塑蛋白复合物的重塑及组蛋白修饰调控机制，以及人类同源SWI/SNF中brg1、snf5等重要亚基的功能。

ATP 依赖的染色质重塑复合物能够通过多种方式改变核小体的状态，从而实现对基因组DNA可及性的调控，其功能异常会影响正常的生命活动。除了部分 CHD 家族成员，其他的染色质重塑复合物都是由一个核心催化亚基和数目不等的辅助亚基构成。研究表明，来自酵母 SWI/SNF 家族的染色质重塑复合物 RSC 能够借助其催化亚基 Sth1水解 ATP、沿DNA移动并滑动核小体。然而，这些过程是如何被调控的还知之甚少。.本研究利用高分辨率光镊技术，发现Sth1以25.7 bp/s的速度沿DNA移动，并能够以较高的频率产生DNA环。DNA 环的尺寸分布是单指数的。数据拟合获得 Sth1 在 DNA 上移动的持续长度为33.9 bp。辅助亚基Arp7-Arp9和Arp7-Arp9-Rtt102能够增加Sth1沿DNA移动的持续长度，却不影响移动速度。另外，这两类辅助亚基还能够减弱Sth1的ATP酶活性。Rtt102的碳末端截短会影响其对Sth1持续长度的增强作用，表明了Rtt102碳末端在调控中的作用。HSA与Post-HSA之间的连接段的氨基酸378-392的删除，会明显影响Arp7-Arp9和Arp7-Arp9-Rtt102对Sth1的ATP酶活性和Sth1沿DNA移动的调控，表明该连接段的关键作用。我们测定了HSA结构域截短的Sth1的DNA移位的参数，结果表明HSA能够降低Sth1沿DNA移动的速度和DNA 环产生的频率，却不影响持续长度。因此，HSA结构域和辅助亚基协同调控Sth1的DNA移位速度和持续长度。另外，HSA能够减低Sth1的ATP酶活和核小体滑动活性。这些结果表明，HSA是一个具有负调控功能的结构域。此外，P1结构域替换后，Sth1仍然保持着较高的ATP 酶活性，却丧失了滑动核小体的能力，并且Sth1的ATP酶活性不能再被Arp7-Arp9和Arp7-Arp9-Rtt102调控。这些结果表明，P1结构域在辅助亚基调控的Sth1的ATP酶活和核小体滑动过程中有重要作用。.我们的研究揭示了Sth1受到自身结构域和RSC复合物中其他辅助亚基协同调节，这有助于我们理解Sth1和RSC复合物的调节机制，并为其他染色质重塑复合物的研究提供线索。