单分子技术解析INO80/SWR1复合物的染色质重塑机制

Appropriate chromosome segregation in mitosis is critical to chromosomal stability. Chromosome segregation defects can result in aneuploidy，which is prevalent in cancer cells correlated with poor prognosis. INO80/SWR1 complexes are crucial for maintaining chromatin structure at centromeres by histones replacement between H2A/H2B and H2A.Z/H2B dimers. Based on our previous studies，we will employ single-molecule techniques combining optical tweezers and fluorescence microscopy, to investigate chromatin remodeling mechanism of INO80/SWR1 with emphasis on their histone replacement behaviors. Single-molecule techniques are especially suitable for studying the dynamic processes conducted by ATP-dependent motor proteins. By combining two technologies, we can qualitatively and quantitatively detect the histone variants replacements and at the same time measure the remodelers’ translocation speed, step size, loop size and processivities. We will utilize reconstituted nucleosomal DNA templates, by in trans adding INO80/SWR1 to the system, observe the dynamic interplay between nucleosomes and remodelers in a real-time manner. Furthermore, we will explore the roles of key subunits of INO80 complex in during chromatin remodeling. The study of histones replacements mechanism at single-molecule level will elucidate the regulatory mechanism of INO80/SWR1 complex in chromosome segregation.

有丝分裂中同源染色体正常分离是保证遗传信息正确传递的关键步骤。而中心粒稳定对这一过程有重要意义。INO80/SWR1染色质重塑复合物能通过组蛋白二聚体H2A/H2B和H2A.Z/H2B的置换及其他一系列重塑功能维持中心粒的稳定，从而保证同源染色体正常分离。以前期工作为基础，拟利用单分子技术，在核小体层面研究INO80/SWR1的重塑机制，侧重组蛋白及变体的置换机制。单分子技术在实时原位测量动态生物过程中有着其他技术难以比拟的优势，可以定量地对依赖ATP水解的分子马达的行为进行表征，提供其动力学信息。本项目拟以H2A/H2B和H2A.Z/H2B两种核小体为模板，实时追踪INO80/SWR1复合物在核小体DNA上移动及组蛋白置换的动态过程，深入剖析INO80重要亚基在重塑过程中的功能及参与组蛋白置换的机理。本研究将从分子机制上深入阐释INO80/SWR1在同源染色质分离中的调节作用。

染色质重塑复合物可以利用ATP水解产生的能量对核小体进行滑动、置换以及去组装，从而调节DNA的可及性，对于维持正常的生命活动有着重要的作用。INO8/SWR1家族复合物作为其中的一员，具有滑动核小体以及置换组蛋白变体的作用，然而INO80或SWR1复合物发挥这些功能的详细动力学信息还未被揭示。本项目利用单分子光镊技术，发现INO80复合物在滑动核小体时并不能产生大的DNA环（loop），这与SWI/SNF家族蛋白Sth1重塑核小体的过程有着较大的差异，意味着二者可能利用两种不同的重塑机制来完成重塑过程。我们还对另一个家族的重塑复合物Chd1进行了生化分子方面的探究，发现DNA末端长度与DNA序列同时影响了核小体滑动方向，并利用单分子光镊技术对其在DNA以及核小体层面的重塑过程进行了较为细致的研究与比较，发现其与INO80复合物类似，也不能在DNA以及核小体上产生大的DNA 环（loop）。利用本项目搭建的光镊系统，我们也研究了驱动蛋白KIF13B在微管上滑动的动力学过程，表明KIF13B在微管上脱离的平均临界力为5.249pN，平均运动速率为37.13nm/s，该数据也得到了单分子荧光成像实验的验证，对于KIF13B蛋白的基本运动属性及其运动规律的揭示将帮助人们进一步理解Kinesin-3驱动蛋白家族的运动特性。我们还研究了CREB复合物的折叠/解折叠机制，发现了CREB复合物解折叠过程中的四种状态，还发现Mg2+可以帮助CREB分子更好地形成稳定的二级结构；我们还研究了SNARE 复合物组装/去组装机制，发现了Complexin可以将SNARE稳定在第2态，在稳定SNARE复合物四螺旋束方面发挥了重要作用。