应用于循环肿瘤细胞单细胞功能分析的集成式微流芯片系统研究

Circulating tumor cells (CTCs) are closely related to cancer metastasis. CTCs have great heterogeneity and only a small part of CTCs have metastatic potential. So to count all CTCs number is not enough. To find the high metastatic potential CTCs and explore the mechanism of cancer metastasis, we should detect each CTC’s function (secreted proteins and intracellular proteins simultaneously detection). For such low number of rare cells (only several to tens in 1ml blood), it is hard to detect at single cell level. It is a trend to use microfluidic chip for CTCs’ single cell functional analysis. Based on previous work，this project is planned to build an integrated microfluidic system for single cell functional analysis of CTCs. This system is composed by three parts: (1) Recapture the CTCs by using the cell’s physical characteristics (surface microstructures, dielectric properties) and biological characteristics (cell surface antigen);(2) Simultaneously detect CTCs’ secreted proteins and intracellular protein by using PDMS valves and high density antibody compound array; (3) Using such system to analysis CTCs from early non-small-cell lung cancer (NSCLC) patients after surgery, we plan to assess chemotherapy and monitor recurrence. In summary, the establishment of such system will contribute to the development of cancer diagnostic technology and provide a more effective platform for cancer metastasis research.

循环肿瘤细胞（CTCs）与癌症转移密切相关，其具有很大的异质性，真正能形成癌症转移的仅占很少一部分，对CTCs进行功能分析（分泌蛋白与胞内蛋白同时检测），找出具有高度转移潜能的CTCs，这对肿瘤诊断具有重要意义。但由于CTCs数目极少（1ml血液只有几个至几十个），对检测提出较高的要求，基于微流芯片的单细胞蛋白分析凭借其独特优势，成为CTCs功能分析的发展趋势。本项目拟在前期工作基础上，构建基于集成式微流芯片的CTCs单细胞功能分析系统,包括:（1）利用CTCs物理特性（表面微观结构、介电特性）与生物学特性（表面抗原），完成CTCs的高效捕获；（2）通过泵阀控制与高密度抗体复合物阵列，实现CTCs单细胞分泌蛋白与胞内蛋白的同时检测;（3）利用该系统对早期非小细胞肺癌患者术后的化疗进行评估及复发监测。本系统的建立将为肿瘤诊断技术的发展做出贡献，为癌症侵袭转移机理研究提供更加有效的技术平台。

循环肿瘤细胞(CTCs)已被证明与癌症的侵袭转移密切相关。然而CTCs数目极少，需要发展高效捕获技术；CTCs 具有很大的异质性，需对发展CTCs单细胞功能分析技术，找出具有高度转移潜能的CTCs。针对以上需求，在本项目中，我们构建了基于微流芯片的CTCs高效捕获与单细胞功能分析系统，并用于非小细胞肺癌患者CTCs功能检测。在完成既定任务基础上，我们还进行了扩展，包括利用CTCs葡萄糖代谢异常进行功能表征，成功实现了CTCs的体外培养，并对CTCs进行了基因突变的协同检测，具体而言：1）利用CTCs物理特性与生物学特性，实现了CTCs高效捕获:前期采用电纺丝作为基底修饰，在微流芯片动态系统中，通过施加电场，CTCs捕获效率达到60%-75%。为进一步提高捕获效率，我们引入鱼骨型芯片结构，利用Matlab和ANSYS FLUENT软件，构建出鱼骨型芯片模型并进行流体仿真，通过调节芯片结构参数，得到最优化捕获效率，创新性的提出了基于双面鱼骨结构的CTCs捕获新方法，用细胞系、模拟血样和患者血样进行了实验验证，得到了高达94±4%的捕获效率，相关研究工作已发表（J. Mater. Chem. B, 2017,5, 9114-9120）。2）利用微流控芯片实现CTCs蛋白检测与功能分析：进行CTCs单细胞功能分析的前提有两个，a）采用快速的方法获得有活性的CTCs，b）将有活性的CTCs分隔在微小单元，以满足检测限的需求。我们采用鱼骨型微流芯片与免疫磁球结合方法，实现温和、快速、高效的CTCs获取与富集，在很小体积(80 μL)的HBSS溶液中，得到高密度的CTCs，加入经过优化培养体系，实现了CTCs体外培养并完成细胞建系，相关论文已发表（遗传，2017,39,66-74）。我们利用微孔芯片实现CTCs单细胞的隔离，不仅能检测CTCs的蛋白表达、还可从基因组、代谢组等多个层次进行单个CTCs分析，相关工作已经申请专利。3）利用该系统对早期NSCLC患者进行CTCs功能检测: 实现了患者CTCs体外培养与器官来源鉴定，并对扩增的CTCs进行了外显子测序、蛋白与代谢功能检测，发现NSCLC患者CTCs确实具有功能异质性，可分为不同子群便于疗效评估与复发监测。综上所述，本项目的研究可提更全面的CTCs异质性信息，这对于肿瘤精准诊疗具有重要意义。