雷莫拉宁生物合成卤化机制及其衍生物的研究

Ramoplanin is a glycopeptide antibiotic that is active against a wide range of Gram-positive bacteria, including methicillin-resistant Staphylococcus aures(MRSA) and vancomycin-resistant Enterococcus faecium (VRE). It is currently in the Phase III clinical trails. Ramoplanin biosynthetic gene cluster has been reported, and its biosynthetic pathway has been basically deciphered, but the mechanism of the halogenation is not yet clear. Conducting the disruption, heterologous expression, and site-directed mutagenesis of the gene encoding the enzymes and proteins in the helogenation of the ramoplanin biosynthesis to elucidate the halogenating mechanism in vivo. At the meantime, cloning and overexpressing these genes, and study the in vitro substrate specificity, and combining with the in vivo results to illuminate the mechanism of the halogenation in the ramoplanin biosynthetic pathway.These work will lead to further improvement on the study of the ramoplanin biosynthesis mechanism. Based on these work, gene engineered strains would be constructed that could yield glycopeptides derivatives with variety sites halogenated, and lay the foundation for innovative medicines with independent intellectual property rights.

雷莫拉宁是由放线菌产生的重要糖肽类抗生素，主要用于对抗临床难以控制和 治疗的 MRSA 和 VRE 感染，目前正处于Ⅲ期临床研究，预计即将上市。雷莫拉宁的生物合成基因簇已经公布，且其生物合成途径也已经基本阐明，但其生物合成过程中的卤化是遵循何种机制尚未明确，这是一个有待解答的科学问题。对编码参与雷莫拉宁生物合成卤化的酶和蛋白进行基因中断、异源表达、定点突变配合外源喂养等操作，在体内确定雷莫拉宁生物合成中的卤化过程；并通过体外克隆、表达这些基因，研究这些酶的功能与底物宽泛性，结合体内研究结果阐明雷莫拉宁生物合成过程中的卤化机制。通过这个科学问题的解答，能够进一步阐明雷莫拉宁的生物合成机制。在确定卤化机制的基础上，通过不同糖肽类抗生素产生菌遗传操作系统的建立，构建能够产生"不同位点卤化的糖肽类抗生素衍生物"的工程菌， 为获得具有自主知识产权的创新药物打下基础。

雷莫拉宁是重要的糖肽类抗生素，其针对万古霉素耐药肠球菌所引起感染的治疗正处于III 期临床阶段，具有良好的开发前景。雷莫拉宁的生物合成过程已基本阐明，但其中的卤化机制尚不明确，特别是卤化发生的时间点、卤化位点选择和影响卤化程度的因素有待解答。.首先对雷莫拉宁、恩拉霉素、complestatin等糖肽类抗生素的生物合成基因簇进行分析，发现其中对应Hpg的A-domain的底物识别特异性氨基酸均为DAYHLGLLCK，说明A-domain对底物的识别无差别，即卤化位点和程度的差异性并非在糖肽类抗生素生物合成过程中底物氨基酸的识别和上载过程中引入。.随后对雷莫拉宁生物合成基因簇中的卤化酶基因ram20进行了中断、回补等操作，实验验证了ram20编码了雷莫拉宁生物合成过程中唯一的卤化酶。.恩拉霉素与雷莫拉宁结构高度相似，且由单一卤化酶End30催化Hpg13加上两个氯原子。在雷莫拉宁卤化酶敲除株中异源表达End30，发现End30仅能催化Hpg17单卤化；在雷莫拉宁产生菌野生型及糖基转移酶敲除株中异源表达则未见新产物。End30与Ram20同源性较高，提示雷莫拉宁和恩拉霉素卤化位点和程度差异除与卤化酶本身性质有关外，还可能与非核糖体肽本身序列有关。.在雷莫拉宁产生菌糖基转移酶敲除株中发现Hpg13 卤化的2-Cl 雷莫拉宁苷元，而野生型中未发现2-Cl 雷莫拉宁。推测Hpg11 上的糖基对卤化酶接触Hpg13 造成空间位阻。敲除糖基转移酶后，糖基造成的空间位阻消失，使Ram20能够卤化Hpg13。糖基化通常发生在环肽形成之后，因此我们推测卤化发生在大环形成之后，且晚于或同时于糖基化。.在研究过程构建基因工程菌，得到无糖、无氯、无糖无氯雷莫拉宁等雷莫拉宁结构衍生物，同时还针对雷莫拉宁产生菌所构建的突变株的发酵、分离纯化工艺进行了优化；尝试对雷莫拉宁的卤化酶进行体外表达，为后续研究打下基础。.我们的研究结果表明雷莫拉宁生物合成过程中的卤化是由ram20催化的，且卤化发生的时间点在大环形成之后，卤化的位点及程度与非核糖体肽本身序列有关，这些结果进一步完善了雷莫拉宁的生物合成机制，为开发不同卤化位点的雷莫拉宁衍生物打下基础。