新型“酶联—荧光高通量筛选模型”用于溶菌酶分子改造的研究

Utilization of antimicrobial agents are widely involved in medicine, food production, agriculture and other areas. In response to the increasingly severe problems of bacterial resistance, antibiotic residues in dairy products and chemical preservatives which cause food safety problem, the development of green, efficient and safe new antimicrobial agents are of great need. Lysozyme, as a powerful natural antibiotic peptide, can be used as an effective alternative to antibiotics and chemical preservatives. However, the usage of lysozyme is greatly harmed by its limited range of bactericidal action, i.e. the lethal effects of lysozyme against gram-negative bacteria are poor. To overcome this problem, we designed a new “enzyme cascading - fluorescent high throughput screening model” for the screening of lysozyme mutants with higher lethal activity towards gram-negative pathogens (Escherichia coli as representatives). In this model, the random mutant library of Antheraea pernyi lysozyme is expressed by yeast cell-surface display, and the determination of lysozyme lethal activity is combined with TEV protease hydrolyzing activity towards fluorescence resonance energy transfer (FRET) substrates releasing from cracked recombinant E. coli strains with a severe chang of fluorescence intensity as a consequentce. Moreover, the establishment of the method provides a new tool for the study of protein structure and function relationship of lysozyme.

抗菌剂的使用广泛涉及医药、食品、农业等诸多领域。为应对日益严峻地细菌耐药性问题、抗生素残留问题和化学防腐剂带来的食品安全问题，迫切需要开发绿色、高效、安全的新型抗菌剂。溶菌酶是一种优异的天然抗菌素，可以作为抗生素和化学防腐剂的有效替代物，在医药、食品和畜牧业领域都具有重要的研究价值。本课题针对天然溶菌酶杀菌范围有限、特别是对革兰氏阴性细菌杀菌能力较弱的突出问题，设计了一种全新的“酶联——荧光高通量筛选模型”，通过酿酒酵母表面支架展示溶菌酶突变文库，并结合荧光能量共振转移 (FRET)底物，将溶菌酶和蛋白酶级联使用，实现对具有广谱抗菌效果、能够有效杀灭革兰氏阴性致病菌（以大肠杆菌为代表）的新型溶菌酶的高效筛选。该方法的建立也为研究溶菌酶蛋白质结构和功能的关系提供了新的工具。

溶菌酶是一类天然抗菌蛋白，能够特异性裂解细菌细胞壁且不易产生耐药性，因此作为抗生素和化学防腐剂的替代品，在医药、食品和畜牧领域具有良好的应用前景。本课题针对天然溶菌酶杀菌范围有限、特别是对革兰氏阴性细菌杀菌能力较弱的突出问题，首次提出并建立了一种全新的“酶联—荧光高通量筛选方法”。该方法以大肠杆菌重组表达FRET荧光底物为基础，将溶菌酶和TEV蛋白酶级联使用，经验证可实现对高活性溶菌酶突变体的快速鉴别和高通量筛选。利用该方法，我们从毕赤酵母表达的柞蚕溶菌酶基因突变文库中，筛选得到了一株酶活提高的突变体。该方法在溶菌酶定向进化筛选方法上是一种新的突破，显示了良好的应用潜力。. 另外，本课题构建了酿酒酵母表面展示系统对柞蚕溶菌酶进行固定化表达，确立了该体系可用于定向筛选高活性的“表面固定式（surface-tethered）”溶菌酶突变体，这对将来制备人工植入物的抗菌表面具有应用意义。此外，我们在研究过程中首次发现了柞蚕溶菌酶N端含有一个非胞壁质酶功能结构域，具有类似阳离子抗菌肽的特征，对溶菌酶裂解细菌能力有直接的贡献，证明了柞蚕溶菌酶抗菌活性并不完全依赖于胞壁质酶活性。在此基础上，我们采用点饱和突变技术对N端的α螺旋结构域进行了突变研究并筛选高酶活突变体，有望更深入揭示溶菌酶的作用机制。