Snapin在PHEV诱导神经细胞自噬过程中的作用机制

Porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus (PHEV) has a strong tropism for the nervous system. Our results showed that PHEV can induce autophagy in nerve cells, however mechanisms of PHEV-induced autophagy is not clear.Snapin-regulated late endosomal transport is critical for efficient autophagy-lysosomal function in neurons and its dysfunction can cause neurological disease.Snapin has been screened and identified which is required for binding spike glyprotein (S) of PHEV in PHEV-infected cells.In order to reveal the pathogenesis of PHEV from the cell autophagy angle,we will study on the process of autophagy and lysosomal function in PHEV-infected cells or S-transfected cells, the change of the function of snapin in the process of PHEV-induced cell autophagy and the effect of autophagy and snapin on PHEV infection and replication by RNA interference or overexpression of Snapin,and enhancement or inhibition of autophagy in PHEV-infected cells or S-transfected cells. The results provide theoretical basis for the pathogenesis of PHEV and new ideas for exploiting target drug to resist PHEV and studying on the relationship of coronavirus infection and cell autophagy.

Snapin能够调控神经细胞自噬过程，其功能紊乱可引起神经系统疾病。研究证实嗜神经性的猪血凝性脑脊髓炎病毒（PHEV）能够诱导神经细胞自噬，且其纤突蛋白(S)能与Snapin互作，推测PHEV可能通过S蛋白干扰Snapin在自噬及溶酶体降解途径中的功能，继而影响病毒的复制和传播，最终导致神经损伤。据此，本项目拟对PHEV感染或转染S蛋白过表达载体前后神经细胞的自噬、自噬降解能力和溶酶体功能等进行检测，明确PHEV/S蛋白对自噬及溶酶体降解途径的影响；RNAi/过表达Snapin或促进/抑制自噬后，接种PHEV或过表达S蛋白，研究神经细胞自噬过程和病毒复制等变化，明确细胞自噬和Snapin对PHEV复制的影响，揭示Snapin在病毒诱导细胞自噬过程中的作用机制。预期结果不仅有利于阐明PHEV的致病机制，为抗PHEV药物研究提供新的思路，而且可为冠状病毒感染与细胞自噬的关系研究提供参考依据。

神经细胞自噬异常能导致神经系统疾病的发生，前期研究发现猪血凝性脑脊髓炎病毒(PHEV)能够诱导神经细胞自噬，但尚不清楚该过程是否完全及病毒对自噬及溶酶体降解途径的影响。因此，为了研究PHEV诱导神经细胞自噬的机制，首先本项目通过一系列自噬的相关实验明确PHEV能够诱导神经细胞发生不完全自噬，且病毒的复制与自噬呈负相关。其次，研究表明Snapin能够调控神经细胞自噬的降解过程，其功能紊乱与神经系统疾病的发生发展密切相关。据此，本项目利用酵母双杂交回转实验、免疫共沉淀以及直接/间接免疫荧光等方法，明确PHEV结构蛋白S1能与Snapin蛋白互作；在细胞中过表达Snapin蛋白后并不影响病毒的增殖，而利用siRNA干扰细胞内源性Snapin蛋白的表达后能抑制病毒的复制；通过研究Snapin，溶酶体相关膜蛋白1(LAMP1)以及LC3在PHEV感染神经细胞后的表达和分布，表明PHEV感染能增加Snapin的表达，溶酶体数量以及LC3I向LC3II的转化，并影响Snapin的分布；揭示Snapin蛋白参与了PHEV诱导神经细胞不完全自噬及影响自噬溶酶体的降解过程，继而影响病毒的复制增殖。再者，一方面研究表明多种冠状病毒的木瓜样蛋白酶(PLP)能够诱导宿主细胞自噬，本项目通过在神经细胞中过表达PHEV的非结构蛋白PLP，并通过一系列相关自噬的检测实验，发现PLP诱导神经细胞发生不完全自噬；另一方面，Beclin1是参与调控自噬的重要蛋白，在自噬体的形成及成熟阶段发挥着重要作用，本项目研究发现过表达PLP增加自噬相关蛋白Beclin1表达，并与其发生互作；而干扰Beclin1的表达能抑制PHEV的复制增殖，表明病毒致神经细胞损伤过程中，通过PLP与Beclin1的相互作用，影响自噬体的形成，为自身的复制增殖提供有利环境。总之，以上的结果表明PHEV可通过S蛋白干扰Snapin在自噬及溶酶体降解途径的功能影响自噬体的形成和降解以及PLP蛋白干扰Beclin1在自噬体形成过程中的功能，最终影响病毒的复制。研究结果为一步不仅有利于阐明PHEV的致病机制，为抗PHEV药物研究提供新的思路，而且可为冠状病毒感染与细胞自噬的关系研究提供参考依据。