基于CPLL和label-free蛋白质组学技术的阔叶十大功劳叶片中生物碱诱导机制的研究

Mahonia bealei is an important medicinal plant of the family Berberidaceae. It contained many active benzylisoquinoline alkaloids. However, the roots and stems of M. bealei (Gonglaomu) are collected as main medicinal parts and the leaves are abandoned, which caused the waste of medicinal resources. Our previous studies showed that the content of alkaloids in M. bealei leaves under UV and dark stresses (active-enzyme induction) was significantly increased. The result of proteomics based on 2-DE showed that the abundance of S-adenosyl-L-methionine synthetase in M. bealei was increased after active-enzyme induction, which might be responsible for the enhanced biosynthesis of alkaloids..In the present study, to explore the mechanism of active-enzyme induction in M. bealei, a gel-free/label-free proteomic technique was used in combination with combinatorial peptide ligand libraries (CPLL). CPLL technique is applied to enrich the low-abundance proteins, which will be beneficial to research the biosynthesis pathway of alkaloids in M. bealei leaves. And the expression of genes related to the biosynthesis of alkaloids under active-enzyme induction in M. bealei was analyzed by qRT-PCR technique. The present study provides not only a new method for low-abundance proteins in medicinal plants, but also a new technique to reveal the biosynthesis pathway of active ingredients in Traditional Chinese Medicine.

阔叶十大功劳是小檗科十大功劳属重要的药用植物，其所含的原小檗碱型生物碱具有多种生物活性。然而其主要药用部位根茎（功劳木）被采集后，叶片常作为废弃物处理，这造成了药用资源的极大浪费。我们前期研究表明，紫外光联合暗培养胁迫（活性酶诱导）下阔叶十大功劳叶片中生物碱含量大幅提高，基于双向电泳技术的差异蛋白质组学研究发现，活性酶诱导促使叶片中的腺苷甲硫氨酸合酶的表达上调可能是影响其生物碱合成的因素之一。.本项目拟采用组合肽配体库技术对阔叶十大功劳叶片中生物碱合成相关的低丰度蛋白进行富集，结合灵敏度更高的label-free蛋白质组学技术，揭示阔叶十大功劳叶片中生物碱合成途径中关键蛋白的表达变化；并应用荧光定量PCR技术对相关基因的表达量进行分析。从蛋白水平诠释阔叶十大功劳叶片响应活性酶诱导的机制，该研究不仅为药用植物中低丰度蛋白的研究提供了新的方法，也为阐明中药活性成分生物合成途径提供新的技术。

阔叶十大功劳是小檗科十大功劳属重要的药用植物，其所含的原小檗碱型生物碱具有多种生物活性。然而其主要药用部位根茎（功劳木）被采集后，叶片长常作为废弃物处理，这造成了药用资源的极大浪费。我们前期研究表明，紫外光联合暗培养胁迫（活性酶诱导）下阔叶十大功劳叶片中生物碱含量大幅提高，基于双向电泳技术的差异蛋白质组学研究表明，活性酶诱导促使叶片中的腺苷甲硫氨酸合酶的表达上调可能是影响其生物碱合成的因素之一。本项目引入了组合多肽配体库技术（CPLL），建立了适用于植物叶片组织的CPLL低丰度蛋白富集方法，结合label-free蛋白质组学和代谢组学技术，进一步诠释阔叶十大功劳叶片响应活性酶诱导的机制。. CPLL低丰度蛋白富集研究结果表明在三种不同pH条件（pH4，7，9）下分别进行CPLL富集处理可以更有效的富集低丰度蛋白，并且pH为9的条件下，高丰度蛋白RuBisCO去除效率最高，而pH4条件下更有利于富集一些新的蛋白。此外，CPLL技术能有效提高次生代谢相关蛋白鉴定的数量。Label-free蛋白质组学分析共鉴定了1057个unique肽段大于等于2的蛋白，其中单纯紫外照射后，有91个蛋白发生显著性变化，活性酶诱导后，有107个蛋白发生显著性变化。差异蛋白的功能分析表明单纯紫外照射和活性酶诱导组相比，TCA循环、RNA、N代谢、signaling以及transport相关蛋白差异最大，其中具有转运小檗碱功能的ATP-binding cassette transporter蛋白仅在暗培养之后发生显著上调表达。随后的targeted和untargeted代谢组学分析共鉴定了371个代谢物，除了原小檗碱外，我们在阔叶十大功劳叶片中首次鉴定了嘌呤、莨菪烷、吲哚和哌啶类生物碱，这些生物碱在活性酶诱导下也发生了不同程度的变化。整合蛋白质和代谢组学结果表明了仅在紫外光照射阶段，生物碱和黄酮的增加用于缓解细胞所遭受的氧化应激胁迫，而原小檗碱类的生物碱仅在活性酶诱导后才增加。这其中水杨酸和赤霉素等激素信号的相互作用调控次生代谢的合成途径。