TIP30调控核内化EGFR信号通路逆转非小细胞肺癌吉非替尼耐药的机制研究

Nuclear EGFR signaling is one of the mechanisms contributing to gefitinib resistance in non-small cell lung cancer.TIP30 is a tumor suppressor which can regulate cell proliferation through several mechanisms. We have found that TIP30 regulated nuclear EGFR signaling pathway through locating in the nucleus or cytoplasm. Our previous experiments have showed that the expression of TIP30 was down-regulated in the gefitinib-resistant pulmonary adenocarcinoma cell line PC9/GR. Overexpression of TIP30 in PC9/GR had influence on cell apoptosis and proliferation.PC9/GR harbored high levels of nuclear EGFR, and overexpression of TIP30 in PC9/GR decreased nuclear EGFR accumulation. Overall, the results highlight the role of TIP30 in gefitinib resistance and provide rationale for the correlation with nuclear EGFR signaling. However the mechanism is unclear. We therefore will investigate how TIP30 regulates nuclear EGFR signaling and restores sensitivity to gefitinib using confocal immunofluorescence, immunoprecipitation, chromatin immunoprecipitation assay and luciferase reporter assay. Reverse resistance to gefitinib should also be studied in animal model. Clinically, TIP30 may be a potential and well-tolerated combinational protein to overcome gefitinib resistance, and provide novel “one target multiple” treatment strategies.

核内化EGFR信号通路激活是非小细胞肺癌吉非替尼获得性耐药的机制之一。TIP30是一种具有多种生物功能的肿瘤抑制基因，我们已证明TIP30蛋白可定位于胞浆和胞核，通过多个环节参与调控核内化EGFR信号通路。预实验中我们发现，吉非替尼耐药的非小细胞肺癌细胞TIP30表达明显降低，耐药细胞株过表达TIP30对其增殖、凋亡均有一定影响。进一步实验发现：耐药细胞株细胞核内EGFR表达明显高于敏感株，过表达TIP30导致核内EGFR水平降低。初步证明TIP30参与非小细胞肺癌吉非替尼耐药的调控，并与核内化EGFR信号通路密切相关，但其分子机制尚不清楚。我们拟通过激光共聚焦、免疫共沉淀、荧光素酶报告基因和染色质免疫共沉淀等技术，探讨TIP30调控核内化EGFR信号通路、逆转吉非替尼耐药的机制，并在裸鼠肺癌动物模型上加以验证。为临床上寻找多途径、整体逆转吉非替尼耐药的治疗靶点，提供新的思路。

吉非替尼是一种表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)，适用于治疗接受过化疗或不适于化疗的局部晚期或转移性非小细胞肺癌(NSCLC)患者。然而，大多数患者会在吉非替尼治疗后 6~12 个月发生不同程度的耐药，最终导致肿瘤进展、药物疗效降低。因此，进一步探索吉非替尼耐药的可能机制，找到合适有效的逆转吉非替尼耐药的方法具有十分重要的意义。TIP30是一种具有多种生物功能的肿瘤抑制基因，我们既往的研究提示TIP30通过定位于细胞内不同位置调节非小细胞肺癌核内化EGFR信号通路。本研究第一次在细胞和动物实验水平证明TIP30参与非小细胞肺癌吉非替尼耐药。我们发现，吉非替尼耐药的非小细胞肺癌细胞（PC9/GR）TIP30表达水平明显降低，耐药细胞株（PC9/GR）过表达TIP30可以敏化吉非替尼的治疗效果，抑制PC9细胞克隆形成和促进细胞凋亡。进一步实验发现：耐药细胞株（PC9/GR）细胞核内EGFR表达明显高于敏感株（PC9），过表达TIP30导致核内EGFR水平降低。TIP30 亦参与负调控核内化EGFR从溶酶体向内涵体的的转运和降解，并与核内化EGFR信号通路下游p-AKT和p-MEK的激活密切相关。我们运用了染色质免疫共沉淀的方法发现过表达TIP30通过抑制核内化EGFR介导的c-myc的转录进一步逆转吉非替尼耐药。同时，我们通过建立PC9细胞的裸鼠动物模型，进一步发现过表达TIP30的PC9 或PC9/GR细胞的皮下肿瘤体积较对照组明显减小。结论：本研究发现TIP30作为肿瘤抑制基因，通过亚细胞层面调控EGFR在胞浆内的转运，以及核内化EGFR下游基因的转录，多途径、全方位抑制核内化EGFR信号通路的激活。TIP30通过对核内化EGFR信号通路的整体调控克服非小细胞肺癌吉非替尼耐药，为临床上寻找多途径、整体逆转吉非替尼耐药的治疗靶点提供了新的思路。