嗜热邻苯二甲酸酯双酯键水解酶的基因挖掘和构效关系研究

Phthalates(PAEs) are ubiquitous pollutants in the environment because they have been widely used for years. The enzymatic degradation research of PAEs and the reported enzymes were not good enough to meet the demand of acting in the real environment. Also, the research on protein engineering and catalytic mechnism of this kind of enzyme has never been involved. In this study, novel thermophilic PAEs hydrolases mediating PAEs-phthalate acid(PA) will be discovered by using genome mining approach from GenBank database. The catalysis mechanism and the structure-function relationship of this novel hydrolase(active on diester bond) , together with the reported EstS1(active on monoester bond) will be investigated by molecular docking and protein engineering. This research will widen two enzymes’substrate scope, improve enzyme acitivity, which can help us to better understand their different catalytic behaviors and add value to the current enzymology theory and their application area.

塑化剂-邻苯二甲酸酯（PAEs）类，由于其使用广泛，已经成为环境中普遍存在的有机污染物。目前其酶法降解研究较少，文献中报道的水解酶稳定性均较差，无法适应实际环境中邻苯二甲酸酯的降解需求；关于该类酶的蛋白改造和催化机制也未有任何报道。本研究拟以邻苯二甲酸酯到邻苯二甲酸的水解反应为研究对象，在基因组数据库中挖掘结构新颖、稳定性好的邻苯二甲酸酯水解酶编码基因；结合已发表的嗜热单酯键水解酶EstS1的同源模型，通过分子对接、蛋白质工程改造的手段分别解析两类不同的酯水解酶 （分别水解双酯键，单酯键）对底物的识别和作用机制，从而拓展酶的催化底物范围，提高酶的催化活力，并进一步丰富现有的酶学知识和酶的应用范围。

邻苯二甲酸酯（PAEs）因为具有提高塑料柔韧性、耐用性和可加工性的特点，被广泛使用于工业生产和日常消费品中。随着时间的延长，PAEs会不断渗透到自然环境中，造成污染。但在极低浓度下就会干扰人和动物的内分泌系统，长期处于PAEs的环境中，很容易致畸、致癌和致突变。因此，PAEs的存在对人类社会具有潜在危害。本研究以塑化剂的无害化处理为研究目标，采用菌种筛选和基因数据库挖掘的手段，通过广泛筛选，得到了一个能够以DEHP为唯一碳源进行生长并降解的菌株Gordonia polyisoprenivorans 5F，并通过对基因组序列的比对和大量筛选，得到了一个具有广谱降解塑化剂能力的降解酯酶GoEst15，该酶对大位阻和长侧链底物塑化剂具有良好的降解作用，这也是文献报道的第一个能够降解大底物塑化剂的水解酶，具有良好的创新价值和应用价值。同时从Gordonia polyisoprenivorans 5F挖掘到了单酯降解酶M1，将GoEst15和M1在大肠杆菌中共表达，实现了从塑化剂PAEs-PA的无害化降解。在第二部分的研究中，我们通过基因组数据挖掘，以Picrophilus torridus DSM9790基因组为模板，得到一个高对硝基苯酚丁酸酯（pNPB）水解活性的中度嗜热酯酶EstPt 1。该酶是报道的热稳定性最高的塑化剂降解酶。为了使塑化剂酶法降解得到实际的应用，设计了开发了一种新型交联聚集体固定化酶的方法，在EstPt 1和有机磷降解酶PoOPHM9中得到了成功的应用。固定化的EstPt 1和有机磷降解酶PoOPHM9在热稳定性、有机溶剂稳定性、pH稳定性和重复使用方面都得到了很大的提升，表明这种以聚醚Pluronic F127为核心介质的固定化方法有可能应用于降解酶的实际田野化应用。具有较好的实践价值。