菜心高/低累积邻苯二甲酸酯特性关键基因的挖掘与功能研究

Phthalate esters (PAEs) are classified as priority organic pollutants that pose carcinogenic, teratogenic and mutagenic effects. In China, PAE pollution in agricultural soils has become increasingly serious, which directly affects the quality safety of agricultural products and thus endangers human health. A novel alternative strategy of screening and studying low-pollutant accumulating crop cultivars (or pollution-safety crop cultivars, PSCs) has been proposed to ensure the safety of agricultural products, but there is seldom study specially focusing on this issue. Based on our previous study on bio-physiology of low- and high-PAE cultivars of Chinese flowering cabbage (Brassica parachinensis L.), this study focuses on an integrated analysis upon the transcriptome and proteome. Combining with analysis of bio-physiology, transcriptome-proteome association and temporal-spatial expression, some key genes which determined characteristics of high- or low-PAE accumulation in Chinese flowering cabbage will be cloned and identified. The transient expression system of key genes will be successfully established for explicitly indicating the sub-cell orientation of these genes. The technologies of RNA silencing, gene overexpression and genetic transformation will be used to investigate the physiologic functions of key genes in the tolerance, transport and accumulation of PAEs in the two cultivars of Chinese flowering cabbage. The results of the study will not only establish the basis for further research on molecular mechanism behind the characteristic of high- or low-PAE accumulation in Chinese flowering cabbage, but will also provide scientific basis and genetic material for molecular breeding of PSCs.

邻苯二甲酸酯（PAEs）是具有“三致”（致癌、致畸、致突变）效应的优控有机污染物。我国农田土壤PAEs污染严重，危及农产品质量安全和人体健康。筛选和研究PAEs低累积特性的作物品种是保障农产品质量安全的重要策略，目前还研究很少。本项目针对华南地区重要叶菜类蔬菜菜心，以前期筛选获得的PAEs高、低累积菜心品种为研究对象，在生理生化研究的基础上，对这两种菜心进行转录组学和蛋白组学比较分析。从功能基因组学角度，结合生理生化特征、组学关联和时空表达验证等分析，深入挖掘和鉴定菜心高/低累积PAEs特性的重要候选基因；通过构建候选基因瞬时表达体系，明确候选基因在两种菜心细胞内的定位情况；采用RNA沉默、超表达和遗传转化等技术，探讨候选基因在两种菜心耐受、转运、累积PAEs过程中的生理功能。研究结果将揭示菜心高/低累积PAEs特性形成的分子机制，为抗污染蔬菜品种分子选育提供科学依据和遗传材料。

近年来，我国农田土壤邻苯二甲酸酯(PAEs)污染严重，直接影响农产品质量安全，严重威胁人体健康。筛选对污染物低累积作物品种是在土壤普遍污染情况下确保农产品质量安全的重要策略。本项目以前期筛选获得的PAEs高、低累积菜心品种为研究对象，在生理生化研究的基础上，对这两种菜心进行转录组学和蛋白组学比较分析。结果表明，低累积菜心品种Lvbao的差异基因主要富集在基础生物学和逆境胁迫响应过程方面，而高累积菜心品种Huaguan中差异基因主要富集抗胁迫反应、细胞结构变化及损伤修复等方面。这说明其对高累积菜心在分子水平上表现出对DBP胁迫具有更高的应激能力，这与前面所述高累积菜心具有更高耐受性的研究结果一致。经过多组学关联分析，筛选鉴定候选蛋白如非特异性脂质转移蛋白基因(nsLTP)、木葡聚糖内糖基转移酶/水解酶基因(XTH)、几丁质酶基因、苯丙氨酸解氨酶基因等，它们可能与菜心高低累积DBP差异密切相关。为了获得菜心转基因株系，我们成功构建了菜心悬浮细胞培养体系。进一步，我们对关键基因nsLTP和XTH进行分子功能研究。以上述菜心转录组数据为基础，经过RACE克隆获得了菜心nsLTP基因全长，该基因全长587bp，属于nsLTP-Ⅰ型蛋白；成功构建了pET-32a-nsLTP原核表达载体和pBI-121-GFP-nsLTP亚细胞定位载体，通过激光共聚焦显微镜观察显示nsLTP蛋白主要定位在细胞壁上。利用分子模拟对DBP和nsLTP蛋白结合模拟分析，结果发现DBP能紧密结合于nsLTP蛋白的H3和H5α螺旋形成疏水性口袋中，表明nsLTP蛋白能与DBP结合形成稳定复合物，在菜心吸收累积PAEs过程中发挥重要作用。此外，通过水培实验研究了两种菜心在DBP污染胁迫下，其根系细胞壁形态、一氧化氮(NO)含量、细胞壁结构、细胞壁各多糖组分、酶学活性以及细胞壁重构酶XTH基因的响应情况。结果表明，说明菜心XTH基因参与调控细胞壁的构成，其通过参与调控细胞延伸生长和调节细胞壁延展性，使菜心细胞壁成分的发生改变，进而影响PAEs在菜心中的吸收累积，从而导致菜心高、低累积DBP差异的形成。总之，研究结果为全面揭示不同基因型菜心高/低累积PAEs性状形成的分子机制奠定了基础。.依托本项目共发表SCI研究论文9篇；申请并获授权国家发明专利1件；协助培养硕士研究生毕业2名，在读博士生2名。