树舌免疫调节蛋白重组表达体系的建立及其免疫调节活性和抗肿瘤活性的研究

树舌是一种具有免疫调节和抗肿瘤活性的重要灵芝品种，但是其有效成分和作用机理并不十分清楚。而树舌免疫调节蛋白是一种从树舌中提取出来的小分子功能蛋白质，属于真菌免疫调节蛋白家族，其很可能是树舌中起免疫调节和抗肿瘤活性的重要物质。从天然材料中提取树舌免疫调节蛋白的产率很低，本研究将以树舌菌丝体为研究材料，提纯其中的免疫调节蛋白，同时从中克隆该免疫调节基因并转入合适的宿主（酵母菌）中进行高效表达，建立和完善树舌免疫调节蛋白的酵母重组表达体系，获得并纯化大量目的重组蛋白，然后研究重组蛋白的免疫调节和抗肿瘤生物学活性，并探讨树舌免疫调节蛋白的作用机理和机制。本研究将首次探究树舌免疫调节蛋白的功能，同时以酵母建立工程菌高效高产地表达目的蛋白，为进一步开发树舌药用价值提供一定参考，同时也为树舌免疫调节蛋白作为保健品甚至药剂开发研究提供物质储备和理论依据。

真菌免疫调节蛋白（FIP）家族是一类从大型真菌中提取的具有免疫调节和抗肿瘤活性的蛋白质，目前已从十二种真菌中发现该类蛋白质，而其中绝大多数来源于灵芝属。树舌灵芝是灵芝属中独立的亚属（组），但对其真菌免疫调节蛋白未见研究报道。本研究以树舌灵芝为材料从中克隆得到了一对新的FIP基因：FIP-gap1和FIP-gap2，对其基因及翻译后氨基酸序列进行分析比对，结果表明树舌灵芝FIP确与已知的FIP具有一定的同源性和差异。从天然真菌中提出FIP效率比较低而且成本高，我们构建了树舌灵芝FIP基因高效真核表达载体并转入毕赤酵母GS115中进行高效重组表达，生物学活性检测表明二者均可以凝集小鼠血细胞而不凝集人血细胞；而促小鼠脾淋巴细胞增值测试，IFN-γ 诱导分泌及YAC-1细胞抑制试验均表明重组FIP-gap2的生物学活性要优于 FIP-gap1。采用染色体步移方法，我们还得到了树舌灵芝FIP基因的启动子序列，该序列具有典型的启动子序列元件和多个非生物顺式作用元件，这为研究FIP表达和调控的分子机理提供一定理论基础。此外，本研究小组还进行了金针菇FIP-fve在毕赤酵母中的诱导型和组成型重组表达。结果表明重组的FIP-fve与天然FIP-fve具有非常相似的生物学活性。此部分研究内容已发表在SCI收录期刊Jounal of Biotechnology和《中国生物工程学报》。本课题将深入研究了树舌灵芝FIP基因和蛋白质的结构及生物学功能，为更广泛的阐明真菌免疫调节蛋白在大型真菌尤其是灵芝属中存在的广谱性以及提高树舌灵芝及FIP的应用开发提供了理论基础，也为全面探究FIP的生物学功能提供了重要参考和依据。