拟南芥COLD1 基因介导的氧化信号传递及转录调控机制分析

Reactive oxygen species as signal molecules involved in many important physiological processes such as plant growth and development, stress response, stomatal movement and cell death. However, the detailed molecular mechanism of the signaling pathways is not fully understood. Our previous work using far-infrared imaging system isolated and identified COLD1 gene, the cold1 mutant showed hyper-sensitive to drought and its leaf surface temperature was relatively low. Here we demonstrate that cold1 mutant also exhibited remarkably sensitive to oxidation and ABA stress in Arabidopsis, which suggested that COLD1 may play a key role in the response to oxidative stress of the plant. Recently, using bioinformatics and biochemical tools, we found that COLD1 could interact physically with H2O2-associated transcription factor HATF1, which presumed that COLD1 may regulate the transcriptional expression of the down-steam genes by the transcription factor HATF1 and achieve the regulation of plant oxidative stress signal transduction. Comprehensive utilization of the multi-disciplinary research techniques, the isolation and identification of the downstream components in ROS signal pathway make us well understand the basic pattern of gene transcription regulated by COLD1 and the molecular mechanism of plant stress response regulated by ROS signaling, which has important theoretical significance in new insight into improving crop water use efficiency and crop improvement.

已知活性氧作为关键信号分子，参与了植物生长发育、逆境应答、气孔运动和细胞死亡等许多重要的生理过程，但对于其调控基因表达的分子机制尚不清楚。我们前期工作通过远红外成像系统成功分离并鉴定一个干旱敏感基因COLD1，其叶片表面温度相对较低，且cold1 突变体对植物激素ABA、氧化胁迫等均高度敏感，这表明COLD1 基因在植物应答逆境胁迫中扮演重要角色。最近利用生物信息学和生物化学手段还发现COLD1 能与H2O2 相关转录因子HATF1 相互作用，推测COLD1 可能通过转录因子HATF1 调控下游基因的转录，引起植物相应的生理生化变化以适应胁迫。以此为线索，本项目希望综合利用多学科研究技术，分离鉴定COLD1 介导的活性氧信号转导下游成分，解析COLD1 调控基因转录的基本模式，阐明活性氧信号调节植物抗逆反应的分子机制。为提高作物水分利用效率和作物改良提供重要的理论探索。

已知活性氧作为重要信号分子介导了多种生物、非生物胁迫反应以及植物生长发育等生理生化过程，是细胞连接外界环境刺激和内部基因表达的重要枢纽之一。研究发现植物体内存在复杂的活性氧应答转录调控网络，经信号整合，调控下游基因转录表达。目前对于这一复杂调控网络中的许多细节，诸如细胞如何感受转导活性氧及如何调控下游基因表达等许多问题仍然所知甚少。. 本项目从干旱敏感基因COLD1入手，证实可与拟南芥GPX3强烈互作并接受其氧化信号，从而实现基于GPX3感知活性氧信号的下游传递，依赖COLD1 Cys371和Cys379分子间二硫键形成和断裂实现调控的。本研究首次揭示COLD1具有向氧性特征，即COLD1会向富含活性氧的亚细胞区域移动并累积，其Cys371和Cys379分子内二硫键是必须的，在COLD1介导的植物氧化胁迫应答过程中扮演重要角色。. 序列分析表明COLD1不具有典型的DNA结合序列，表明其可能作为一个转录调节因子起作用。利用酵母双杂交、体内免疫共沉淀以及双分子荧光互补等实验证明COLD1作为转录调节因子可与的转录因子HATF1在核内发生互作。HATF1作为C2H2锌指蛋白转录因子家族的重要成员之一，是活性氧信号转导的标志性蛋白，且受活性氧诱导。通过基因枪介导的瞬时表达系统证明HATF1能显著增强其顺式作用元件A(G/C)T和CATTGA的转录活性，COLD1作为负转录调节因子对于HATF1对顺式作用元件的激活起到了微弱的抑制作用。定量PCR结果展示活性氧信号转导下游基因APX2、PDF1.2a的表达受到HATF1正调控，即在氧化胁迫下hatf1中APX2、PDF1.2a表达量显著降低。cold1/hatf1双突变体中，APX2、PDF1.2a表达水平又都受到了一定程度的上调，证明COLD1作为转录调节因子部分地抑制HATF1对下游基因转录激活。. 以上研究结果表明COLD1作为氧化还原信使在胞内可与GPX3互作接受氧化信号并保持胞内活性氧动态平衡，在核内与转录因子HATF1相互作用调控活性氧信号转导网络下游基因表达，且证实COLD1的核质运动正是协调这个转导网络的分子开关，Cys160则是COLD1核质运动的保守核心位点。本研究为阐明活性氧应答的转录调控模式提供了重要的基因组学和遗传学线索。