拟南芥过氧化氢酶基因的转录后和翻译后调控机制研究

Catalases are essential for scavenging hydrogen peroxide and maintaining the cellular redox state in plants. Catalases are involved in plant development and respond to biotic and abiotic stresses. However, the mechanisms underlying the post-transcriptional and post-translational regulation of catalase in plants remain elusive. Based on bioinformatics, RT-PCR and RNA-seq analyses, we have found recently that Arabidopsis CAT2 and CAT3genes undergo alternative splicing. According to data obtained from the plant phosphorylation database, CAT1 and CAT3 are modified by phosphorylation. In this study, we propose to employ approaches such as RNA-seq, in vivo fluorescence microscopy, protein interaction assays including GST-pull down and yeast two-hybrid, enzymatic activity and protein kinase assays to investigate the following questions: how do post-transcriptional processing and post-translational modification affect the subcellular localization, activity and stability of catalases?; does phosphorylation of CAT1 and CAT3 affect known interactions with CaM, SOS2,LSD1 or NDPK1?; does SOS2 or other unknown protein kinases phosphorylate CAT1 and CAT3? This project will provide important information on how hydrogen peroxide sensing and signaling are controlled by post-transcriptional and post-translational regulation of catalase.

过氧化氢酶是细胞内清除过氧化氢，维护植物体内氧化还原势平衡，参与调控植物生长发育以及生物和非生物胁迫应答的重要蛋白。但是迄今为止，与过氧化氢酶基因的转录后和翻译后调控相关的工作非常少，而且没有得到系统的研究。我们的生物信息学分析和预实验表明过氧化氢酶基因受到选择性剪接调控，翻译后受到磷酸化修饰。本课题在上述发现的基础上，采用RNA-seq数据分析、活体荧光观察、体外和体内蛋白互作，酶活性分析以及激酶活性实验等方法，研究过氧化氢酶基因的选择性剪接和磷酸化修饰对其亚细胞定位，活性，稳定性的影响。阐明CaM，SOS2, LSD1 和NDPK1等蛋白与过氧化氢酶的互作是否受磷酸化修饰的调控，并鉴定SOS2等蛋白是否是磷酸化过氧化氢酶的蛋白激酶。本研究成果将揭示过氧化氢酶基因如何通过转录后和翻译后调控，影响过氧化氢酶的生理生化功能，调控细胞内的过氧化氢的水平和它参与的信号传导途径。

过氧化氢酶是细胞内清除过氧化氢，维护植物体内氧化还原势平衡，参与调控植物生长发育以及生物和非生物胁迫应答的重要蛋白。但是迄今为止，与过氧化氢酶基因的转录后和翻译后调控相关的工作非常少，而且没有得到系统的研究。我们的研究发现，CAT2和CAT3通过选择性剪接，产生了定位于胞质中的过氧化氢酶，可能在植物生长发育或应答逆境胁迫过程中起一定作用。CAT1和CAT3的磷酸化修饰并不影响其与SOS2、LSD、CaM等蛋白的互作，但显著下调过氧化氢酶的活性。CAT2的蛋白水平受光周期的调控，EBF1/2可能参与调控CAT2的蛋白降解。我们利用CAT2和CAT3特异性的抗体，发现CAT2和CAT3的对盐胁迫、干旱胁迫、氧化胁迫的响应存在非常明显的差异。CAT2蛋白在盐胁迫条件下诱导表达，在盐胁迫的恢复期降解。而CAT3蛋白并不受盐胁迫诱导表达，在盐胁迫后的恢复期诱导表达。另外，我们利用CRISPR技术构建了CAT1/3双突变体和CAT1/2/3三突变体。CAT1/2/3三突变体表现出明显的生长缺陷和剧烈的氧化还原波动。转录组学分析表明在转录水平cat2/3和cat1/2/3均与野生型存在较大差异，且cat1/2/3差异基因数量明显更多。进一步的分析表明过氧化物酶体产生的H2O2可能通过OXI1-MAPK途径参与调控过氧化物酶体逆行信号。