细胞色素P450介导的二氢黄酮生物合成及羟基化催化机制研究

Aromatase inhibitor is a primary drug for the therapy for breast cancer. Flavanone has a good aromatase inhibitory activity and it has been reported that introducing hydroxyl group in the flavanone B ring 3', 4' and 5' positions can improve the aromatase inhibition activity. Applying Cytochrome P450 and introducing hydroxyl groups directly and selectively to an aliphatic or aromatic ring, this is a very effective method to achieve the structure transform of flavanone and improve its activity. In the preliminary study, applicant has investigated plant's flavanone hydroxylation Cytochrome P450（CYP75A, CYP75B）. However, the operation is complex and express in vitro is difficult because there exists the membrane binding region in the plant P450 gene N-terminal. Finding flavanoe hydroxylation P450 from the easy-operation microorganism will contribute to the finding efficiency of compounds with activity. Based on this and in this project, we will focus on the Cytochrome P450s of S.avermitilis, establish the recombinant E. coli co-expression system and screen P450 genes which have flavonone hydroxylation activity. According to the screened P450, a separated recombinant expression system for P450 enzyme will be established, the tertiary structure of P450 will be analyzed and the molecular mechanism of catalysis will be clarified. This proposed project will provide a theoretical basis for obtaining flavonone with aromatase inhibition activity.

芳香化酶抑制剂为乳腺癌治疗的主要药物。近年的研究发现，二氢黄酮类化合物有较好的芳香化酶抑制活性，在二氢黄酮的B环3’、4’、5’位导入羟基均提高了芳香化酶抑制活性。利用细胞色素P450直接而且选择性地引入羟基到脂肪族或芳香族环链，实现二氢黄酮的结构改造，提高活性是一个很有效的方法。申请人在前期工作中，针对植物的二氢黄酮羟基化P450（CYP75A、CYP75B）进行研究，但因植物的P450基因N端存在膜结合领域，操作复杂，不易体外表达。从易操作的微生物中发现二氢黄酮羟基化P450将有助于活性化合物发现效率。本项目在此基础上，针对S.avermitilis 的细胞色素P450，建立重组大肠杆菌共表达体系，筛选出具有二氢黄酮羟基化活性的P450基因；根据筛选得到的P450，建立单独P450酶重组表达系，解析P450三级结构，阐明催化分子机制，为更有效地获得芳香化酶抑制活性二氢黄酮提供理论依据。

细胞色素P450酶在细菌体内参与各种化合物的生物合成及异物代谢等重要的生理反应，该类酶因其直接而且选择性地引入羟基到脂肪族或芳香族环链，实现化合物的结构改造而引起了化学家和生物学家的极大关注。已知二氢黄酮类化合物对治疗乳腺癌具有积极的作用，而美伐他汀是高效的降胆固醇药物，已有研究表明在该类底物分子中引入羟基均可提高化合物的活性。.在本项目中，①我们从阿维链霉菌的33个P450基因中筛选出了CYP105D7基因，构建了CYP105D7-CamACamB全细胞生物转化体系。②利用此体系进行了针对黄酮类化合物的筛选，结果发现CYP105D7针对二氢黄酮类化合物，即柚皮素与松鼠素进行羟基化。其中对柚皮素进行3’位羟基化生成圣草酚。③我们还发现针对美伐他汀及双氯芬酸钠也进行羟基化反应，分别产生C6位羟基化产物普伐他汀和C4’位羟基化产物4’-羟基双氯芬酸钠。④我们建立了CYP105D7单独表达系，通过表达、纯化、晶体化，获得与双氯芬酸钠结合的复合体单晶，并进行了X射线衍射实验。通过解析P450三级结构，阐明了羟基化分子机制。⑤作为拓展研究，为了提高催化效率，我们在不同生物来源的还原伴侣Pdx/Pdr、seFdx/seFdR、RhFRED作用下进行了美伐他汀的的体外生物转化，结果均产生两个产物，其中产生普伐他汀的转化率分别为6.3、1.8和14.7%，RhFRED作用下的转化率为最高。该结果印证了还原伴侣蛋白的选择对生物转化效率的影响及重要性。.综上所述，我们发现了CYP105D7针对各种药物的生物催化能力，阐明了催化分子机制，并进一步利用基因工程、酶工程手段构建了多种电子传递体系，提高了生物转化效率，为CYP105D7作为生物催化剂的工业应用提供了理论依据。.