黑曲霉中羟基化修饰莪术二酮P450酶的发现及功能研究

Curdione is one of the main components in the clinically used essential oil of Rhizoma Curcumae. Through biological and chemical transformation of curdione and its stereoisomers by Aspergillus niger, we developed a library of lead compounds that contains 16 pairs of enantiomers. Moreover, in this library, the hydroxylated-curcumalactones that have unique structure and potential bioactivity could be derived further. To elucidate which P450s in A. niger were responsible for the hydroxylation and to prepare derivatives of curdione and curcumalactone with high activity and selectivity, in this project, we will perform ‘in-silico’ analysis of P450 in the genome of A. niger, transcription analysis of P450 in A. niger during hydroxylation, knock out of P450 in A. niger based on CRISPR/Cas9 and heterologous expression of P450 by Aspergillus oryzae. The discovery and functional analysis of P450 in A. niger will inspire the bioactivity research of molecules with curdione and curcumalactone skeletons. The methods used in this research will also give new insights into the functional analysis of genes in Aspergillus.

莪术二酮是临床用药莪术油中的关键活性成分，申请人在前期工作中，利用黑曲霉羟基化修饰莪术二酮及其立体异构体，结合化学转化制备了含有16对对映异构体的先导化合物库，该库中具有独特结构及潜在生物活性的羟基莪术内酯类化合物还具有进一步衍生的能力。为了阐明黑曲霉体内150余个P450中哪一个或者哪几个参与了羟基化修饰莪术二酮及其异构体，并实现高活性、高选择性地制备莪术二酮、莪术内酯类衍生物，申请人拟开展对黑曲霉基因组中P450的“in-silico”分析、黑曲霉羟基化修饰时体内P450的转录分析、基于CRISPR/Cas9技术对黑曲霉中相关P450的敲除以及P450基因在米曲霉中异源表达。通过这四部分内容的研究，发现黑曲霉中参与羟基化修饰莪术二酮及其异构体的P450，并对其功能进行分析。本项目能够为莪术二酮和莪术内酯类化合物的活性研究提供源头支持，也能够为曲霉中其它相关基因的研究提供新思路。

镜像关系的羟基化莪术二酮、莪术内酯是一类具有独特结构及潜在生物活性的药物先导化合物，为了高活性、高选择性地制备莪术二酮、莪术内酯类衍生物，申请人在本研究中首先希望通过寻找黑曲霉中的P450酶并研究其功能来实现目标。然而米曲霉异源表达系统中内源性的羟基化活性限制了该方案的进一步实施，为此申请人选择了具有高催化活性和广底物谱的P450BM3单加氧酶作为催化剂对莪术二酮及其异构体的羟基化修饰进行了进一步研究。通过利用微整形策略，即将活性腔中可能与底物存在相互作用的氨基酸分别替换成比其自身体积略大和略小的氨基酸来考察不同氨基酸对选择性的影响，并结合酶与底物之间存在的弱相互作用的分析来指导P450BM3突变体的设计，申请人仅经过一到三轮的突变，就获得了对莪术二酮及其异构体C2和C3位高区域选择性和立体选择性羟基化的P450BM3突变体，其中针对4个产物羟基化的选择性达到95%以上，3个羟基化产物的选择性达到90%以上。该研究中对莪术二酮的选择性羟基化修饰有望为该类化合物的开发提供源头支持，使用的策略也对P450酶及其它酶的蛋白质工程改造提供了一定的理论参照。