基于肠上皮细胞/免疫细胞“对话”探讨黑灵芝多糖的肠黏膜免疫调节作用及机制

Polysaccharides could not only be fermented by intestinal microflora, but also activate the intestinal mucosal immune system. Recent studies suggested that intestinal epithelial cells not only involved in the innate immune response, but also could make a “cross-talk” with intestinal mucosal immune cells. Therefore we intended to explore the effect and mechanism of Ganoderma atrum polysaccharides on intestinal mucosal immune regulation basing on the “cross-talk” between intestinal epithelial cells and immune cells in this project. Focusing on the effect of PSG-1 on the "cross-talk" between intestinal epithelial cells and intestinal immune cells, this project is prepared to establish LPS-induced cells co-culture models and a DSS induced colitis animal model. To elucidate the regulatory role of PSG-1 on intestinal mucosal immunity, intestinal epithelial barrier and repair function and the parameter of cytokines, cell phenotypes, cells grouping of Mø, DCs and γδT-IEL will be tested when the “cross-talk” in disorder. We are ready to further use autophagy as a breakthrough point, specifically assaying expression of key autophagy protein in Mø、DCs、γδT-IEL, to nvestigate the role of autophagy in effects of PSG-1 in the “cross-talk”, and reveal the regulatory mechanism of PSG-1 on intestinal mucosal immunity. This project will provide experimental evidence for the efficacy of Ganoderma atrum polysaccharides, and offer a new idea for the scientific research of active ingredients of other Chinese herbal medicines.

多糖除了被肠道微生物酵解，还可以激活肠粘膜免疫系统。近年研究发现，肠粘膜上皮细胞不仅参与固有免疫反应，并且与肠黏膜中的免疫细胞存在着复杂的“对话”机制，因此本项目拟基于肠上皮细胞/免疫细胞“对话”探讨黑灵芝多糖的肠黏膜免疫调节作用及机制。通过建立LPS刺激的细胞共培养模型和DSS结肠炎动物模型，聚焦于肠上皮细胞与肠道免疫细胞间的“对话”，研究PSG-1对“对话”紊乱状态下，肠上皮细胞屏障与修复功能，Mø、DCs、γδT-IEL的细胞因子、表型、分群等指标的影响，阐明PSG-1对肠粘膜免疫的调节作用；进一步以细胞自噬为切入点，靶向检测Mø、DCs、γδT-IEL自噬关键蛋白表达，从体内和体外水平研究自噬相关通路在PSG-1调控肠上皮细胞和肠道免疫细胞“对话”中的作用，揭示PSG-1对肠粘膜免疫的调节作用机制。本项目将为黑灵芝多糖的药效提供实验证据，同时为其他中药活性成分的研究提供新的思路。

多糖与肠粘膜免疫系统密切相关。近年研究发现，肠粘膜上皮细胞不仅参与机体固有免疫反应，并且与肠黏膜中的免疫细胞存在着复杂的“对话”机制，因此本项目基于肠上皮细胞/免疫细胞“对话”，探讨黑灵芝多糖的肠黏膜免疫调节作用及机制，主要研究内容及重要结果如下：.1.黑灵芝多糖对DCs以及Caco2-DCs共培养模型炎症反应的调节作用。本研究结果表明PSG-1不仅在LPS诱导的巨噬细胞炎症模型中具有直接抗炎作用，在肠样Caco-2/巨噬细胞共培养炎症模型中也具有间接抗炎作用，且这种抗炎作用与MAPKs信号和Nrf2/Keap1信号有关。.2.基于RNA测序探究黑灵芝多糖间接调节肠黏膜树突状细胞免疫功能的作用机制。PSG-1刺激能激活DCs中NF-κB和MAPK通路继而上调Caco-2/DCs共培养模型中下室DCs中炎症细胞因子和趋化因子的表达。不仅如此，PSG-1还能通过Caco-2细胞的TNF-α和NF-κB信号通路间接调控DCs免疫功能。.3.黑灵芝多糖对丙烯醛诱导的巨噬细胞损伤的保护作用及其机制。PSG-1可以上调小鼠体内的自噬水平以恢复环磷酰胺造成的小鼠肠道损伤。同时，PSG-1可以通过激活Nrf2/Keap1通路缓解ACR对巨噬细胞的氧化应激并通过自噬依赖性的细胞凋亡保护ACR诱导的巨噬细胞损伤。.4.黑灵芝多糖对DSS诱导的结肠炎小鼠的保护作用。PSG-1干预能改善小鼠的表观指数，维持肠道屏障的完整性。此外，PSG-1缓解了肠道中DC的异常活化且增强了DC分泌IL-10的能力，其中自噬和凋亡途径参与了PSG-1对于肠道的保护作用，这可能与Akt/mTOR通路密切相关。.5.黑灵芝多糖对ACR诱导的IEC-6细胞凋亡和自噬通量的保护作用。PSG-1能降低ACR诱导的IEC-6细胞中的氧化应激水平以及恢复TJs蛋白表达，从而提升细胞活力。此外，PSG-1能激活mTOR信号通路，继而缓解细胞异常自噬与凋亡。进一步的研究结果显示，细胞内自噬和凋亡是相互调节的，且均对TJs的表达具有正向调控作用。.本课题从体内和体外水平揭示了PSG-1对肠粘膜免疫的调节作用机制，并探究了自噬相关通路在PSG-1调控肠上皮细胞和肠道免疫细胞“对话”中的作用。这将为黑灵芝多糖的药效提供实验证据，同时为其他中药活性成分的研究提供新的思路。