Zbtb1基因在T细胞发育过程中调控IL-7Rα表达的功能和机制研究

Zbtb1 is a member of the zinc finger and BTB domain containing protein family of transcriptional factors, which is critical for T cell development. In previous study, we found that Zbtb1 can regulate the expression of IL-7Rα during T cell development of mouse. IL-7 signaling is transduced by the IL-7 receptor, which is essential for T cell maturation and differentiation. As developmental defects of T cells induced by Zbtb1 mutation, the present study aimed to investigate the regulation of IL-7Rα gene expression by Zbtb1 gene. We’re going to overexpress Zbtb1 gene in vitro and in vivo, which can confirm the inhibitory effect of Zbtb1 on IL-7Rαexpression. The binding of Zbtb1 to cis-element related to IL-7Rαexpression will be identified by Biotin ChIP-seq technique. The key sites of cis-element for Zbtb1 binding will be mutated by CRISPR-Cas9 technique in a mouse DN thymocyte cell line (D1). The differential regulation of IL-7Rαwill be tested in wild type and mutant D1 cell line by overexpression of Zbtb1, which can illustrate the molecular mechanism for IL-7Rαregulation by Zbtb1. The results for this study will shed light on the function and mechanism of Zbtb1 on T cell development.

BTB-ZF转录因子家族的成员Zbtb1对T细胞发育至关重要。在我们的前期研究工作中发现，Zbtb1在小鼠T细胞发育过程中能调控IL-7Rα的表达。IL-7信号由IL-7受体传导，它对T细胞成熟和分化至关重要。本项目针对Zbtb1基因突变导致T细胞发育缺陷的现象，从Zbtb1基因调控IL-7Rα的表达方面入手，拟采用在体外和体内水平过表达Zbtb1蛋白水平的方法，确定Zbtb1基因对IL-7Rα表达的抑制作用。通过Biotin ChIP-seq技术，寻找Zbtb1结合的与IL-7Rα表达相关的顺式作用元件。在小鼠DN胸腺细胞系(D1)中通过CRISPR-Cas9技术突变与Zbtb1结合的顺式作用元件的关键位点，在野生型和突变型D1细胞系中检测过表达Zbtb1对IL-7Rα表达调控的差异，可阐明Zbtb1调控IL-7Rα表达的分子机制。研究结果将完善Zbtb1基因调控T细胞发育的功能和机制。

BTB-ZF转录因子家族的成员Zbtb1对T细胞发育至关重要。在我们的前期研究工作中发现，Zbtb1在小鼠T细胞发育过程中能调控IL-7Rα的表达。IL-7信号由IL-7受体传导，它对T细胞成熟和分化至关重要。为深入研究Zbtb1调控T细胞发育的分子机制，首先，本研究以Zbtb1基因野生型和突变型（ScanT）小鼠为研究材料，明确Zbtb1的缺失在小鼠T细胞发育过程中对IL-7Rα表达的影响。在体外和体内条件下阐明过表达Zbtb1对IL-7Rα表达的影响。研究结果表明在体外和体内条件下，Zbtb1和IL-7Rα信号传导均能够彼此相互调节，相互抑制。为了探讨Zbtb1基因促进淋巴细胞发育的机制和对髓系细胞产生的影响，采用的方法为使用逆转录病毒在造血干细胞中过表达特定基因，并于OP9/OP-DL1系统中进行体外分化。发现Zbtb1突变体（ScanT）的造血干细胞在体外淋巴细胞诱导条件下，发育为髓系细胞，得到Zbtb1基因可以促进T细胞发育并抑制髓系细胞发育的结果。淋巴细胞分化条件下Zbtb1基因的突变可上调Csf1r的表达。接下来，我们利用CRISPR-Cas9基因敲除技术构建Zbtb1缺失的小鼠T淋巴瘤EL4细胞株，并通过Hi-C、ATAC-seq、RNA-seq等技术对缺失组和正常组进行系列生物信息学分析，最终Hi-C结果发现缺失组染色质相互作用强度随距离衰减的程度减弱、染色体的交互程度发生了明显的减弱、AB compartment区域发生明显的转变、TAD结构的紧实程度变低；ATAC-seq结果发现缺失组染色质开放区域减少、开放程度减弱；RNA-seq结果发现了7,778条差异表达的mRNA以及其他的ncRNAs的变化、对差异表达的mRNA进行KEGG富集，结果发现其中显著富集在Th1 and Th2 cell differentiation、Th17 cell differentiation等通路中。我们的实验结果第一次从染色体空间结构、染色质开放程度的等方面阐述了Zbtb1基因的对于T细胞发育和淋巴细胞生成、细胞凋亡的重要意义，在未来对相关Zbtb1基因的深入研究提供了相关理论依据和数据支撑。