乳酸菌胞外多糖生物合成的转录调控机制研究

Streptococcus thermophilus is widely used in food industry e.g., fermented milk production. Exopolysaccharide (EPS) in S. thermophilus attracts the attention by its immense physiological function and industrial potential. Despite EPS biosynthesis in S. thermophilushas been studied, the transcriptional regulation of EPS biosynthesis is still unknown. We hypothesize that both pathway-specific transcriptional regulator and other types of regulators (e.g., the global regulators) control EPS biosynthesis at the transcriptional level. This project will focus on EPS biosynthetic gene cluster in S. thermophilus S-3, which could produce a new EPS. Using the methods of molecular biology and bioinformatics, EPS biosynthesis regulated by EPS pathway-specific transcriptional regulator epsA will be elucidated with identifying DNA binding site of EPS promoter (Peps.) Moreover, other types of regulators interacting with Peps will be isolated and identified DNA binding sites. This project will elucidate the transcriptional regulation of EPS biosynthesis in S. thermophilus, which could be an important paradigm for understanding of EPS biosynthesis and regulation in Lactic acid bacteria.

嗜热链球菌广泛应用在发酵乳等食品工业生产中，其胞外多糖（EPS）因独特的理化特性和生理功能而备受青睐。尽管目前对嗜热链球菌EPS生物合成已有一定的了解，改变外界环境和EPS生物合成相关基因的表达都可调控EPS合成，但对其具体的调控机理研究仍偏少，特别是转录调控机制尚未解析。我们推测除EPS基因簇中途径特异性调控因子，嗜热链球菌还存在其它类型调控因子（如全局性调控因子）转录调控EPS合成。基于此，本项目以自行分离的嗜热链球菌S-3菌株所产新EPS生物合成基因簇为研究对象，利用分子生物学和生物信息学等方法，研究EPS基因簇中途径特异性调控因子的转录调控机制。寻找和鉴定与EPS基因簇启动子相互作用的其它类型调控因子，解析其对EPS合成的转录调控机制。本项目从分子水平来阐明嗜热链球菌EPS合成的转录调控网络，深化对乳酸菌EPS生物合成的认识，为提高益生乳酸菌活性功能提供理论基础。

尽管嗜热链球菌基因组早已完成测序，但其胞外多糖（exopolysaccharide，EPS）基因簇转录调控尚未解析。通过鉴定EPS生物合成转录调控因子，不仅能加深对EPS生物合成的理解，还能有效提升EPS合成效率。嗜热链球菌S-3是本实验室分离筛选的一株EPS高产菌株。项目以S-3为研究对象，通过RT-PCR检测eps基因簇共转录单元，筛选出PdeoD，PepsA，PepsG和PepsH为S-3的eps基因簇启动子。构建这4种eps启动子荧光报告质粒，荧光检测表明这4种eps启动子强度不同，其中PdeoD启动子强度较高，达到乳酸菌目前报道最强组成型启动子P23强度的74%。eps基因簇生物信息学分析表明，epsA基因编码LytR家族调控蛋白，存在跨膜结构，是EPS生物合成潜在的途径特异性调控蛋白。由于EpsA蛋白没有成功实现异源表达，采用截去N端跨膜区策略成功在大肠杆菌中表达含LytR结构域的Truncated_EpsA蛋白。EMSA和BLI结果显示纯化后的EpsA蛋白经乙酰磷酸盐磷酸化后可特异性结合PepsA，PepsG和PepsH，表明EpsA是EPS生物合成的途径特异性调控因子。在S-3中过表达epsA，使EPS合成提高了24%，并促进PepsA，PepsG和PepsH下游基因epsB、epsG、epsH、epsJ和epsK转录，转录水平提高了3-4倍，表明EpsA是EPS生物合成的转录激活因子。为鉴定EPS生物合成的全局性调控蛋白，通过链霉亲和素磁珠pull-down亲和层析捕获PdeoD结合蛋白，LC-MS/MS鉴定和结合验证结果显示CcpA和ArgR为潜在的全局性调控蛋白；凝胶电泳迁移实验（EMSA）和生物膜层干涉（BLI）结果显示异源表达纯化后的CcpA和ArgR均可特异性结合PdeoD和PepsA，表明CcpA和ArgR可转录调控EPS生物合成。在S-3中分别过表达和弱化ccpA和argR发现，CcpA可降低EPS合成量达33%，抑制PepsA下游基因转录；ArgR可降低EPS合成量达15%，抑制PepsA下游基因转录，说明CcpA和ArgR是EPS生物合成的转录抑制因子；结合位点突变验证结果表明CcpA和ArgR均可结合PepsA的Pribnow区，抑制启动子功能，且CcpA在胞内与ArgR竞争PepsA，抑制下游基因转录过程中具有优势。