利用TIE2条件性突变小鼠模型研究EGFL7在静脉畸形发生发展中的作用及机制

Mutation TIE2-R849W is the most frequent mutation type in cutaneomucosal venous malformation (VMCM). Via overexpressing humanized TIE2-R849W in transgenic zebrafish embryos, there exits egfl7-related defect of caudal venous plexus (CVP). At present, although EGFL7 has been identified to be essential for normal vasculogenesis, there is no direct evidence to prove the role and mechanism of EGFL7 in venous malformations. Moreover, compared with the mouse model, this zebrafish model still has limitations. Therefore, the applicant hypothesized that: ① Mutation TIE2-R849W is the driver gene that causes VMCM; ② EGFL7 performs a key role in TIE2-R849W related venous malformations; ③ Through regulating the NOTCH signals of vascular endothelial cells and smooth muscle cells, EGFL7 would induce abnormal migration and location of endothelial cells, and weaken the recruitment of smooth muscle cells, leading to vascular development defects. Based on these hypotheses, this project intends to establish a TIE2-R849W conditional mutant mouse model. Via in vivo and in vitro experiments, we intend to clarify the pathogenic role and mechanism of EGFL7 in venous malformations. Combined with exon sequencing and clinical analysis, as potential biomarkers, related molecules would be examined and verified. Finally, all these study results would help to clarify the internal mechanism of TIE2-R849W related venous malformations, so as to provide reference for disease prevention and control.

家族性皮肤粘膜静脉畸形（VMCM）多携带TIE2-R849W突变，申请人通过TIE2-R849W相关斑马鱼模型，发现其存在同egfl7相关的尾静脉丛发育障碍，但同血管发育相关的EGFL7在静脉畸形中的地位及作用机制尚无论证，且该模型相较于小鼠模型仍有局限。因此，申请人提出假设：①TIE2-R849W是引发VMCM的驱动基因；②EGFL7在TIE2-R849W相关的静脉发育异常中起到关键作用；③EGFL7通过调控血管内皮细胞及平滑肌细胞的NOTCH信号，引发内皮细胞异常的迁移及定植，减弱对平滑肌细胞的募集，进而导致血管发育缺陷。因此，本课题拟构建TIE2-R849W条件性突变小鼠模型，基于体内外模型阐明EGFL7-NOTCH通路在静脉畸形中的地位及作用机制，结合外显子捕获测序及临床分析，探讨相关分子作为生物标志物的潜力，阐明TIE2-R849W相关静脉畸形的内在机制，为疾病的防治提供参考。

静脉畸形（Venous Malformations，VMs）是头颈部常见的先天性静脉发育异常，TIE2突变是其重要的分子遗传学特征，但内皮细胞TIE2突变在静脉畸形中可能的致病机制尚不完全明确，相关裸鼠或斑马鱼模型难以满足深入研究的目的。据此，本研究首先系统性回顾了国内外静脉畸形相关测序研究，明确了普通静脉畸形最常见的突变基因是TIE2（41.3%），而其最常见的位点及类型是L914F；最常见的发病部位是四肢（59.3%），其次是头颈部（27.4%）。头颈部静脉畸形会携带更高频率的TIE2突变（70.3%），罕见PIK3CA突变，明确了头颈部“高TIE2 基因突变率”的这一遗传学特征。结合上海九院口腔病理数据库649例静脉畸形，颌面部高发部位为唇、颊、腮腺咬肌区、颌下区等，而口腔及口咽部为颊黏膜、舌等。对14例样本测序后发现，TIE2突变携带率最高（21.4%），首次发现TIE2胞外段突变M247I，提示一种新的基于TIE2-配体异常结合的潜在致病理论。而首次在2例非TIE2/PIK3CA突变样本静脉畸形中鉴定出国内外未曾报道的CDH11突变，则提示可能存在以平滑肌功能异常为核心的新的致病理论。在回顾总结的基础上，基于VMCM经典TIE2突变TIE2-R849W，通过设计、构建高效、特异的sgRNA及其载体，利用CRISPR/Cas9基因编辑系统，最终将鼠源突变R848W序列插入至小鼠基因组中。通过PCR凝胶电泳鉴定及基因测序获得F0代小鼠，随后，利用杂交技术获得稳定遗传的F1代小鼠。借助B6-G/R荧光报告小鼠，探究并验证了Tie2-Cre和Apln-CreERT小鼠中重组酶的时空特异性以及诱导效率。最终，成功构建了国内外首个静脉畸形相关TIE2突变转基因小鼠模型，即Tie2-R848Wfl/fl;Tie2-Cre和Tie2-R848Wfl/fl;Apln-CreERT纯合阳性小鼠，为后续深入的表型观察分析及分子研究提供了创新的动物模型。最后，基于静脉畸形相关TIE2突变转基因小鼠模型，发现并鉴定突变影响下肺部微血管发育障碍，基于肺部病变的高通量转录组测序分析结果、小鼠视网膜血管发育分析、体外细胞模型及临床病例分析，明确了TIE2突变影响下平滑肌表型转化这一区别于其他类型静脉畸形的特征性改变，丰富了对静脉畸形类型及致病机制的理解。