用基因确认标签技术（GIS）筛选东方蜜蜂的抗螨基因

狄斯瓦螨是全球西方蜜蜂的头号大敌，而东方蜜蜂已进化形成了一套完善的防御瓦螨的机制。本研究采用一个对狄斯瓦螨易感的中蜂群突变体和相应的野生型蜂群为材料，在接种瓦螨12h后，使用"基因确认标签"（GIS）技术比较分析经蜂螨胁迫后的工蜂脑组织的转录组，获得的差异表达的基因，进而与国外用基因芯片所筛选的148个西蜂抗螨相关基因相比较，即可获得一批与抗螨性状密切相关的基因；用PET双标签作为PCR引物对，通过 RT-PCR快速克隆这些抗螨基因的全长cDNA序列，分析其结构，并使用荧光定量PCR等技术分析其时空表达调控特性，及验证这些基因是否受蜂螨胁迫诱导或抑制。研究结果可在分子水平上阐明蜜蜂的抗螨机制，对蜂螨的防治和蜜蜂抗螨育种有指导意义。此外，项目执行所产生的海量PETs序列，以及前期工作中所获得50万条来自于中蜂工蜂脑组织ESTs序列，为日后开展东方蜜蜂全基因组序列的功能注释提供了宝贵数据。

狄斯瓦螨是西方蜜蜂的头号大敌，而其自然寄主东方蜜蜂则已进化出完善的防御机制。本研究在分析中蜂抗螨机制的基础上，以基因组学和转录组学手段对抗螨相关基因进行了筛选。研究发现，中蜂的抗螨性状表现为蜂群对雄蜂子的季节性控制、工蜂的抗螨行为及工蜂在形态学上不利于蜂螨附着。为了筛选抗螨基因，首先以454焦磷酸测序技术分析了中蜂的脑转录组，并用所获得的469,162条ESTs序列对中蜂全基因组序列进行功能注释和拼装质量评价。研究发现中蜂基因组总共含有10,179个蛋白编码基因，其中98%有ESTs序列对应，97%与已知蛋白有同源性，8,767个蛋白含有已知结构域，7,343个蛋白可被GO分类，7,713个蛋白可被KOG分类，3,849个蛋白具有KEGG直系同源基因,433个基因为中蜂所特有；此外研究发现约8%的基因在脑组织中选择性剪接。进而用RNA-Seq技术从转录组水平分析了蜂螨感染对中蜂蛹的影响及工蜂抗螨行为的分子基础。雄蜂蛹中受蜂螨感染诱导和抑制的基因分别为172个和621个。其中受蜂螨感染诱导的基因显著富集于亨厅氏综合症途径和丙酮酸代谢途径，而表达下调基因则富集于发育和神经突触等途径，说明蜂螨感染不仅会影响雄蜂蛹的神经系统发育，且能导致蛹能量代谢水平增高。然后用比较转录组的方法分析了接种蜂螨后表现不同行为的工蜂的头部表达基因。与对照组相比，在中蜂工蜂的自我清理行为组和摆动组中表达上调的基因分别为502个和48个，其中42个基因共同上调；下调基因分别为11个和60个，其中6个基因共同下调；在表现为自我清理蜂螨行为的西蜂头部中表达上调和下调基因分别为4,444个和132个，其中包含所有的48个共同上调和下调基因。所筛选的抗螨行为相关基因涉及细胞周期控制、细胞骨架、翻译后修饰等多个细胞过程，但与神经和气味敏感性并无紧密关联。该结果暗示抗螨行为是利用在进化上保守的基因来实现。进一步对中蜂工蜂行为成熟的机制进行了探索，发现在脑组织中6,722个基因在行为成熟过程中表达水平发生明显变化。对RNA-Seq数据的GO和KEGG分析显示，相对于与哺育蜂，在采集蜂和侦察蜂的脑部表达上调的基因明显富集于氧化磷酸化途径、三羧酸循环、脂肪酸氧化等重要能量代谢途径，表明外勤蜂脑部的能量代谢能力高于哺育蜂；脂肪动员素基因的表达与工蜂行为成熟过程中体脂含量的动态变化相偶联，暗示Akh可能通过控制体脂代谢