东方蜜蜂抗螨主效基因筛选和功能研究

Varroa destructor is the greatest threat to the honeybee, Apis mellifera, throughout the world where it rarely causes serious harm to its native host the Eastern Honeybee, Apis cerana, so screening out genes involved in resistance to Varroa mites of A. cerana may provide useful insights for A. mellifera. In this study, the transcriptomes and proteomics of two A. cerana colonies were analyzed. One colony was highly affected by mites whereas the other colony displayed strong resistance to V. destructor. We determined differences in gene expression in the two colonies before and after challenge by V. destructor. Real-time PCR and SNP was performed in both A. cerena and A. mellifera to validate these differentially expressed genes screened out by the sequencing approach and sufficient consistency was observed between the two methods. The objective of this study was not only to identify possible genes involved with resistance to V. destructor parasitism, which may provide insights into A. mellifera resistance, but also can provide moleculer markers for the breeding of mite-resistant Honeybee.

狄斯瓦螨是西方蜜蜂最严重的传染性病虫害，而其原始寄主东方蜜蜂在长期进化过程中形成完善的抗螨机制，通过对不同蜂螨耐受性东方蜜蜂相关功能基因比较研究可为西方蜜蜂抗螨基因筛选提供重要线索。本项目拟利用在东方蜜蜂遗传资源调查中获取的蜂螨敏感型与耐受性蜂群，采用de novo转录组测序技术，获得不同蜂螨耐受性群体工蜂头部组织差异的表达基因；同时通过蛋白质组学分析，获得不同蜂螨耐受性群体工蜂头部组织差异表达蛋白及其对应的基因。综合转录组学与蛋白组学的结果，并通过在西方蜜蜂群体内及工蜂个体相关验证试验和多态性分析，验证蜜蜂蜂螨耐受性主效基因功能，同时确定相应分子遗传标记，为通过传统育种手段与现代转基因技术培育西方蜜蜂抗螨新品种奠定基础。

狄斯瓦螨是对蜜蜂威胁最大的病虫害，几乎对全世界范围内的养蜂业都造成了巨大的损失。本课题利用蜂螨敏感型群体，采用Illumina Solexa测序技术及iTRAQ技术初步筛选出蜂螨抗性相关的候选基因，对候选基因利用RNA干扰技术验证进行探索性的研究。本研究为进一步研究蜜蜂抗螨分子机理奠定基础，同时筛选出来的差异基因可为蜜蜂抗螨育种研究提供基因资源。结果如下：.1. 选择狄斯瓦螨感染的西方蜜蜂巢脾对蜂群胁迫，采用以下措施降低各群体间的遗传背景差异：a）蜂螨胁迫抗性群体和敏感性群体接受蜂螨感染程度相当且具有数量相当的工蜂和雄蜂的封盖蜂房的西方蜜蜂巢脾；抗性对照组及敏感性对照组使用未受瓦螨感染的西方蜜蜂巢脾。b）采用10对微卫星引物选择全同胞姐妹用于下一步实验。c）在螨胁迫后24h时抗螨行为达到高峰时采样。.2. 转录组分析显示，抗性群体和敏感群体间存在免疫反应、肌肉发育、学习和记忆方面的差异，有71个DEGs被富集到了嗅觉转导通路中，说明可能两个群体间的嗅觉系统存在显著差异；抗性及敏感性群体在受到蜂螨胁迫时发生了不同的应答反应，抗性群体产生了一定的应答反应，多条显著富集的pathway涉及病菌感染及抗菌物质的生物合成，说明抗性群体在受到蜂螨胁迫时也同时受到了细菌的感染，同时通过自身免疫积极抵抗细菌，敏感性群体嗅觉功能发生了变化，可能形成了短期记忆，多条显著富集的pathway涉及细菌及病毒感染，说明敏感性群体对于细菌病毒的抵抗力低于抗性群体。iTRAQ 定量分析说明蜂螨抗性及敏感性群体生命活力存在差异，在受到蜂螨胁迫时抗性体内发生了不同的应答反应，而敏感性群体的生命活动受到了影响，这与测序转录组结果相符。结合所有差异基因的GO及pathway显著富集分析结果进行进一步的分析，发现以下基因与抗螨相关：气味结合蛋白、肌钙蛋白、钙离子运输ATPase、转录因子、免疫相关基因、表皮蛋白、突触蛋白。.3. 项目组尝试使用多种siRNA技术对候选基因进行验证和筛选工作，以期筛选出与蜜蜂抗螨性状相关的遗传标记。采用饲喂siRNA法及注射siRNA法两种实验方案，实验取得一定的进展，但蜜蜂的存活率很低，存活下来的蜜蜂生命力很弱，并不适合抗螨实验。