芥蓝BaODD在2-羟基-3-丁烯基硫苷生物合成中的功能研究

The 2-hydroxybut-3-enyl glucosinolate (Progoitrin, PRO) synthesized in Brassica crops has biological activities including induction of goiter disease in mammals and production of bitter flavors in Brassica vegetable crops. This is a major impediment for the use of Brassica crops as it reduces their nutritional quality and potential value. The formation of PRO from its precursor, 3-butenyl glucosinolate (Gluconapin, NAP), requires 2-oxoacid-dependent dioxygenase (ODD) in Arabidopsis. To date, there is no study on function analysis of the ODD gene in the Brassica crops. Our previous results suggest there are big differences in the conversion efficiency of PRO from NAP (PRO/NAP) among different genotypes of Chinese kale. This provides a basis for the further study of the molecular mechanism of the synthesis of PRO. In this study, cloning the BaODD gene and its promoter will be conducted in genotypes of Taoshanzhonghua (PRO/NAP:0.04) and Shengzhong (PRO/NAP:2.31) of Chinese kale. The relationship between PRO/NAP and its expression patterns of mRNA as well as protein level will be investigated. Overexpression and RNAi of BaODD will be performed on genotypes of Taoshanzhonghua and Shengzhong respectively to study the function of BaODD as involved in the biosynthesis of 2-Hydroxybut-3-enyl Glucosinolate. The present study will help explain the molecular mechanism for the difference in PRO/NAP among different genotypes of Chinese kale, which will provide a basis for the generation of low-PRO Brassica crops by genetic engineering and breeding.

芸薹属蔬菜中的2-羟基-3-丁烯基硫苷（PRO）对动物有致甲状腺肿的潜在威胁，且是其苦味的主要来源，严重影响了芸薹属蔬菜的营养品质和商品价值。拟南芥中PRO由2-含氧依赖性双加氧酶（ODD）催化3-丁烯基硫苷（NAP）羟基化形成，但目前还未见芸薹属ODD的功能分析。课题组研究发现不同芥蓝基因型NAP向PRO转化效率（PRO/NAP）相差数十倍，为研究PRO的合成提供了代表性的材料。本研究将以芥蓝基因型省种（高PRO/NAP）和桃山中花（低PRO/NAP）为材料，克隆和分析芥蓝BaODD基因及其启动子，并从转录和翻译水平研究BaODD的表达模式与PRO转化效率的关系。构建该基因表达载体和RNAi干涉载体分别转化桃山中花和省种，验证BaODD在2-羟基-3-丁烯基硫苷合成中的功能。从分子水平解释NAP向PRO转化效率差异的原因，为通过基因工程创制低PRO含量的芸薹属材料提供理论基础。

芸薹属蔬菜中的2-羟基-3-丁烯基硫苷（PRO）对动物有致甲状腺肿的潜在威胁，且是其苦味的主要来源，严重影响了芸薹属蔬菜的营养品质和商品价值。拟南芥中PRO由2-含氧依赖性双加氧酶（ODD）催化3-丁烯基硫苷（NAP）羟基化形成，但目前还未见芸薹属ODD的功能分析。本研究测定了芥蓝11个不同组织部位的转录组，获得98,180基因片段，对这些基因的表达模式进行了系统分析。发现了大量硫苷合成相关基因，其中106个基因可能在硫苷合成途径中起作用，27个基因与硫苷合成辅助途径有关，46个基因可能包含在硫苷的降解代谢过程中，32个基因可能与硫苷调控相关。我们分析了这些硫苷合成基因在芥蓝不同组织部位的表达模式，发现大部分基因在根、叶柄和老叶中表达量较高，并用qPCR技术验证了其中部分基因的表达模式。随后我们克隆了3个芥蓝BaODD基因及其启动子序列，分析了基因序列特点。研究了3个BaODD基因的表达模式与NAA向PRO转化效率的关系，确定了BaODD1为控制NAP向PRO转化的关键候选基因。研究了BaODD1在不同品种、不同组织部位、不同激素处理和高温胁迫下的表达模式，发现该基因的表达趋势与PRO/NAP的比率趋势相一致。在PRO/NAP值较高的省种幼苗中BaODD1的表达量高于其它基因型。另外，在高温胁迫下BaODD1表达上调，经茉莉酸甲酯处理表达也上调。为了验证该基因的功能，我们构建了BaODD1的超表达载体和RNAi干涉载体，并转化芥蓝，获得了转基因植株。相比于野生型植株，超表达BaODD1基因的转基因植株中PRO硫苷含量以及PRO/NAP的值都提高，而BaODD的RNAi干扰植株PRO转化效率降低。本研究验证了BaODD1在2-羟基-3-丁烯基硫苷合成中的功能。从分子水平解释了NAP向PRO转化效率差异的原因，为通过基因工程创制低有害硫苷PRO含量的芸薹属材料提供了理论基础。