建立以细胞为载体的E3泛素连接酶小分子调节剂的高通量筛选平台

通过泛素-蛋白酶体途径所调控的蛋白质降解在维持细胞的正常生物学功能上具有极其重要的作用，其失调会导致包括癌症在内的许多重大疾病。因此，以特定的E3泛素连接酶作为靶点蛋白来进行药物筛选越来越受到研究者们的重视。由于传统的以细胞为载体进行筛选的方法信噪比过低，无法满足高通量筛选的需要，目前对E3泛素连接酶小分子调节剂的筛选都是应用体外方法，因此具有很大的局限性。我们通过应用泛素融合蛋白技术，引入了内源参照报告蛋白，大大提高了应用细胞作为载体筛选的信噪比和可信度，并以我们长期以来一直研究的、在TGFbeta信号通路和癌症发生发展中起重要调节作用的E3泛素连接酶Smurf1为靶点，建立了一个以细胞为载体的高通量筛选Smurf1小分子调节剂的方法，为获得Smurf1的小分子抑制剂提供了有效的方法，也为进一步深入研究Smurf1的功能并得到新的抗癌药物的先导化合物提供了新的途径。

通过泛素-蛋白酶体途径所调控的蛋白质降解在维持细胞的正常生物学功能上具有极其重要的作用，其失调会导致包括癌症在内的许多重大疾病。因此，以特定的E3 泛素连接酶作为靶点蛋白来进行药物筛选越来越受到研究者们的重视。由于传统的以细胞为载体进行筛选的方法信噪比过低，无法满足高通量筛选的需要，目前对E3泛素连接酶小分子调节剂的筛选都是应用体外方法，因此具有很大的局限性。我们建立了以双荧光蛋白（蓝色荧光蛋白ECFP和黄色荧光蛋白EYFP）分别作为内源参照和目标报告蛋白，成功地构建了以细胞为载体的双荧光蛋白的E3泛素连接酶小分子的高通量筛选系统，并利用该系统筛选到了E3泛素连接酶Smurf1的特异性小分子抑制剂。令人感兴趣的是，我们的得到的一个Smurf1的抑制剂Csn-B同时也是核孤儿受体Nur77的激动剂，因此我们进一步研究了Smurf1与Nur77之间的关系。我们发现Smurf1可以通过非典型性的泛素化修饰来抑制Nur77的K48的泛素化修饰，从而拮抗JNK信号通路诱导的Nur77的泛素化降解来稳定Nur77。同时，我们发现Smurf1对于Nur77的这种稳定作用对于抗癌药物顺铂诱导的细胞凋亡起着重要的作用。更有意思的是，细胞中的第二信使cAMP通过激活PKA来诱导Smurf1的T306的磷酸化，而Smurf1的T306的磷酸化对于其稳定Nur77又是必须的。因此，我们的结果不仅揭示了Smurf1调控Nur77稳定性的分子机理，同时提出了顺铂耐药性的另一个可能的分子机理，也提供了顺铂与cAMP协同治疗癌症的可能性的理论基础。