LncRNA-OAR分子对绵羊骨骼肌发育调控机制研究

LncRNAs plays an important role in the regulation of animal growth and development. One of the most important LncRNAs involved in the skeletal muscle development has been identified (named LncRNA-OAR) in our research groupby sequencing and bioinformatics analysis. the function and the molecular mechanism of LncRNA-OAR has been studied by CRISPR/Cas9,c-KLAN. Through the gain and loss (gain/loss function) research , related transcription factors and gene methylation differences analysis, we will found the target gene of lncRNA - OAR and the impact on the downstream signaling pathways, builting the regulation network model and revealing regulation of the targets. Target gene and its corresponding Signaling pathways will be explained and great significance be clarified that the molecular mechanism of animal muscle cell proliferation, differentiation. This research will provide a scientific basis and technical support in the sheep molecular assisted breeding and growth promotion formulation.

长链非编码RNA(LncRNA)对动物的生长、发育具有重要调控作用。课题组前期通过测序和鉴定分析发现了一个与绵羊骨骼肌生长发育相关LncRNA分子（命名为LncRNA-OAR）。为了进一步明确LncRNA-OAR分子如何调节绵羊骨骼肌发育？揭示LncRNA-OAR 调控绵羊骨骼肌发育的分子机制，采用CRISPR/Cas9和c-KLAN技术，通过功能获得与缺失（gain /loss function）研究及相关转录因子和基因甲基化差异分析，明晰lncRNA-OAR的靶基因及对下游信号通路的影响，构建其调控网络模型，发现调控靶点；通过ChIRP-seq等方法进行与lncRNA-OAR结合的DNA、RNA、蛋白质的相关性分析，明确其相应的靶基因及调控方式，对阐明动物肌细胞的增殖、分化的分子机制具有重要意义，并可为肉羊分子辅助育种和开发新型的促生长制剂提供科学依据和技术支持。

LncRNA是一类长度大于200个nt且不表现出蛋白质编码潜能的RNAs。参与了X染色体沉默，基因组印记以及染色质修饰，转录激活，转录干扰，核内运输等多种重要的调控过程，涉及到表观遗传调控、转录调控及转录后调控等多个层面。最新报道LncRNA分子可以调节人和小鼠的肌肉功能，但LncRNA对肉用家畜肌肉分化发育调控的研究尚无报道。本研究通过高通量测序的手段筛选到一个的可以促进绵羊肌肉细胞分化，促进成肌生成的LncRNA分子(命名为Lnc-SEMT)，试验分析发现它对骨骼肌发育具有重要调控作用. 该分子的研究为阐明动物肌细胞的增殖、分化的分子机制具有重要意义，并可为肉羊分子辅助育种和开发新型的促生长制剂提供科学依据和技术支持。主要研究结果如下： .1.通过对胚胎期90日和120日绵羊背最长肌样品进行高通量测序，筛选得到了一个在骨骼肌中特异性高表达的上调LncRNA。.2.通过检测绵羊不同生长时期的Lnc-SEMT表达水平发现，在胚胎期120日龄是，其表达量最高，出生后逐渐降低，表达水平变化不大。.3.将Lnc-SEMT过表达到绵羊成肌细胞后，在0-5天内，随着成肌细胞的生长分化，MYOG和MYOD基因也随着升高。.4.构建了Lnc-SEMT的高表达和干扰载体，分别转染到绵羊成肌细胞，通过DAPI和MyHC试验分析，结果表明随着成肌细胞分化过程中Lnc-SEMT的过表达和干扰，MYOG，MYOD和MyHC基因随着Lnc-SEMT的变化而变化。.5.通过显微注射的手段，得到了5只转Lnc-SEMT绵羊。转基因绵羊的Lnc-SEMT表达水平是非转基因绵羊的3.3倍。.6.通过对转Lnc-SEMT绵羊出生后的体重进行测量，发现突变羊在3月龄，6月龄和9月龄的体重都显注高于对照组。另外屠宰试验中突变羊的胴体重也显著高于对照组。.7.通过对转Lnc-SEMT绵羊进行HE染色和免疫荧光染色，发现突变羊的肌纤维的横截面积显著高于对照组，另外，突变羊的30-45μm直径的肌纤维显著高于对照组。.8.对Lnc-SEMT于miR-125b的结合位点进行突变，并进行体外转染试验，发现miR-125b存在与Lnc-SEMT有潜在的结合位点，同时Lnc-SEMT与miR-125b竞争性的结合IGF-2，以实现促进成肌细胞分化和成肌生成的作用。.9.通过对转Lnc-SEMT绵羊的血清进行检测，发现转