乳源活性肽P5在Caco-2细胞模型中的促钙转运分子机制

Milk and milk-derived casein peptide phosphate are accepted as effective food materials to promote calcium absorption for a long time. The exact active monomers and molecular mechanisms to promote calcium transport become a hot topic in recent years. At present most studies mainly focus on the absorption and transport of calcium, while give less attentions on the metabolic pathway of the active factors. At the same time, although several calcium transport channel proteins, such as TRPV5 and TRPV6, have been found, the full-scale calcium transport mechanisms need further research. The active peptide monomer will be purified from enzymatic hydrolysis of casein and the chemical structure will be identified. Based on the Caco-2 cell model, the metabolic pathway of the active peptide monomer will be studied, and the calcium transport mechanism of the active monomer will be clarified using the technology of genome and protein group. The results of this proposal will provide the scientific theories and foundation for the usage of peptides with promoting calcium absorption activity products from milk-derived casein.

牛奶和乳源性酪蛋白磷酸肽长期作为公认的促钙吸收食品应用于生活和各类产品中，其确切物质基础，尤其是促钙转运机制成为近年来研究的热点。目前多数研究主要把注意力放在钙元素的吸收和转运方面，对这一过程中促钙吸收因子的代谢途径未给予更多关注。同时，虽然目前已发现TRPV5 、TRPV6等钙转运通道蛋白，但全面揭示促钙吸收因子的钙转分子机制有待深入研究。本项目通过建立Caco-2细胞模型，采取生物活性追踪法分离制备乳源酪蛋白酶解产物中的高活性促钙吸收肽单体，并鉴定其化学结构；同时以Caco-2细胞模型为依托，揭示促钙吸收肽单体在钙转运过程中的代谢途径，并从基因组和蛋白组方面阐明活性单体促钙转运的分子机制。本研究成果将为乳源促钙吸收肽钙转运机制的发展提供新的理论依据。

钙是维持人体健康的重要矿质元素，研究开发高活性促钙吸收因子具有重要的现实意义。本课题主要研究如下：（1）获得乳源钙结合肽的酶解制备的最佳工艺条件，并在此基础上，以钙螯合率为检测指标，得到钙肽最佳螯合条件，随后对钙肽复合物的螯合性质进行了研究。（2）从酪蛋白酶解物中分离纯化钙结合肽，并确定其对Caco-2细胞单层钙和镁摄取的影响。分离得到5个命名为P1至P5的单体肽，并确定了其氨基酸序列。结果表明，与不空白对照组相比，5个单体肽均显示对钙和镁吸收的显著增强作用，其中P5活性最强。此外，当钙和镁与P5同时存在时，镁的吸收优先于钙。在此基础上，进一步在大鼠模型上考察P5对体内钙吸收代谢的影响。结果表明P5能有效提升大鼠肠钙吸收和骨钙沉积。（3）以天然乳源活性肽P5（含四个磷酸根）和合成P5（不含磷酸根）为研究对象，对比两者体外钙结合活性及在Caco-2细胞单层模型上的促钙转运活性和代谢途径。结果表明，天然活性肽P5的体外钙螯合活性是合成P5的5倍，说明磷酸根可能在肠钙转运中发挥重要作用，其具体作用机制有待深入研究。同时，高效液相色谱和质谱结果均表明天然P5和合成P5在促钙转运的同时，其本身及降解产物均能实现跨Caco-2细胞膜转运。（4）利用RNA-seq高通量测序技术和iTRAQ蛋白组学技术研究乳源活性肽P5促钙转运分子机制。结果表明，天然活性肽P5能够引起Caco-2细胞的转录水平和蛋白水平表达的显著性差异。转录组测序GO富集结果显示，“cellular response to calcium ion”是差异基因最显著富集的生物过程，“symporter activity” 是最显着富集的分子功能（MF）。KEGG富集结果显示，MAPK signaling pathway是最显著富集的途径，mineral absorption pathway和 protein digestion and absorption pathway存在于前20 KEGG富集途径。与促钙吸收相关基因CLDN15、DMT1、SLC16A4、SLC39A4、S100A6、S100G、KCNN4、Fos、Jun、TEF1、和PEPT1等的mRNA表达水平显著上调。其中DMT1,PEPT1和SLC16A4的蛋白表达水平上调。