基于冷冻电镜近原子分辨率三维结构的BmCPV复制机制研究

Bombyx mori Cytoplasmic Polyhedrosis Virus (BmCPV) is one of the simplest dsRNA viruses in Reoviridae. Our recent study results indicated that BmCPV transcription was dependent on the interactions of structural proteins that caused by conformational change of capsid protein. We have established a high efficiency MultiBac expression system and obtained recombinant E.coli containing different foreign genes. And, Virus-like Particles can be assembled and purified via infecting sf9 cells directly. Then we can obtain 3–4Å structure of atomic resolution using cryo-electron microscope and three dimensional reconstruction. It will interpret the active sites and biological functions between different structural proteins. At the same time, the results can show the structure mechanism of BmCPV replication. We can reveal biochemical mechanism of BmCPV replication through detecting NTPase activity of different BmCPV-VLPs/mVLPs, turret protein (TP) and mutational TP proteins. The results could illustrate the signal transduction pathway of BmCPV virus proliferation that mediated by NTPase with biochemical molecular biology and structural biology. This study might make it more clear of the virus replication mechanism, such as CPV genus, Reoviridae or segmental dsRNA virus. And it will supply effective targets on drug design, disease control against Reovirus, such as rotavirus, BTV, IBDV, and etc.

家蚕BmCPV是呼肠孤病毒科中结构最简单的dsRNA病毒之一，申请人等前期研究认为CPV转录是依赖于衣壳蛋白形变引起的结构蛋白之间的互作。本项目拟利用课题组已建立的MultiBac多基因高效表达系统，通过体外构建含CPV不同结构蛋白基因的重组菌株，直接侵染sf9等细胞，制备不同的VLPs，利用cryoEM三维重构获得3-4Å的近原子分辨率结构，解析BmCPV不同结构蛋白之间互作的活性位点和生物功能，阐明BmCPV复制的结构机制。通过测定BmCPV不同VLPs、TP和突变型mTP蛋白等NTPase活性，阐明BmCPV复制的生化机制。将生化与结构机制有机结合，诠释NTPase介导的BmCPV增殖/复制信号传导通路的分子机制，为RV、BTV和IBDV等呼肠孤病毒的药物设计提供新的靶标，有望推动CPV属、Reoviridae科或分节段dsRNA病毒“吸附→入侵→复制→释放”共性规律和防治策略研究。

家蚕质型多角体病毒（Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus, BmCPV）属于呼肠孤病毒科（Reovirdae），是蚕桑产业中重要的病原微生物之一。BmCPV病毒为无囊膜病毒，病毒的dsRNA基因组包裹在单层的正20面体衣壳中；沿着5次轴处，衣壳内部附着有与dsRNA基因组相互作用的RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp），而衣壳外部具有5个塔状突起蛋白（TP）构成的塔状突起，负责病毒mRNA的加帽与成熟。通过不同结构蛋白的协同配合，BmCPV病毒粒子在拥有SAM及dNTPs的环境下既可完成mRNA的转录及加帽成熟，并在宿主细胞中进行增殖复制。.尽管BmCPV病毒的大部分结构蛋白已获得了高分辨率三维结构，但对于病毒进行转录及加帽的分子机理仍然缺乏足够的研究。因此，我们设计了如下实验，来揭示BmCPV病毒是如何利用关键结构蛋白及宿主蛋白调控完整的转录加帽的过程。.首先，我们利用分子生物学手段点突变BmCPV的TP蛋白，验证了TP蛋白具有ATP水解酶的功能，证明了前人关于TP蛋白通过分解ATP提供能量帮助病毒感知胞内环境并激活病毒转录的猜想；其次，利用冷冻电镜三维重构，我们解析了7个不同方法处理的BmCPV病毒高分辨率三维结构，发现了5种不同转录状态下的RdRp-RNA复合物结构，这些结构共同揭示了BmCPV病毒是如何通过RdRp的构象变化来调控RNA的走向，并协调完成病毒的转录；此外，我们还利用免疫共沉淀技术，验证了TP蛋白可与宿主碱性磷酸酶（ALP）进行特异性相互作用，并通过RNA干扰及过表达验证了ALP可以促进病毒在宿主细胞内的增殖复制，推测ALP可以帮助TP蛋白完成病毒mRNA的加帽；最后，我们通过对病毒核壳蛋白（CSP）进行点突变，验证了CSP蛋白上关键氨基酸位点可以保证病毒结构的完整性。这些实验共同阐释了BmCPV病毒如何通过结构蛋白的相互作用，保持病毒的结构刚性，并允许这些结构蛋白进行构象变化以及与宿主蛋白进行相互作用，完成病毒的内转录以及mRNA的加帽，帮助病毒在宿主细胞内进行增殖复制。上述研究结果顺利的完成了该项目预期的研究目标，并为后续有关BmCPV病毒复制增殖机制的研究提供了理论基础。