硫化氢抗脑缺血-再灌注损伤的嘌呤信号机制

A novel pathophysiologic insight into ischemia injury is that ATP-P2X7 purinergic signaling pathway mediated cerebral ischemia-reperfusion. But the role of this pathway in hydrogen sulfide's protection against ischemia-reperfusion injury has not been reported so far. In previous study, we found that hydrogen sulfide protected brain against ischemia-reperfusion injury. In current study， we will observe the effects of endogenous and exogenous hydrogen sulfide on the ATP release pattern and degradation velocity, expression and activity of P2X7 receptor in neuron and neuroglia, membrane current,intracellular calcium, cytokines such as tumor necrosis factor(TNF-1α), interleukin 1β and Nitric Oxide in global cerebral ischemia-reperfusion rats in vivo and oxygen-glucose deprivation model in vitro. In these experiments, the microdialysis, RNAi and patch clamp technique will be used. We will investigate the regulation of hydrogen sulfide for ATP-P2X7 signaling pathway at three levels including pre-receptor(release and metabolism of ATP using the natural ligand of P2X7 receptor), receptor(expression and activity of P2X7 receptor) and post-receptor(intracellular signal transduction) in order to reveal a new endogenous mechanism of cytoprotection and to provide some new idea in clinic treatment in cerebral ischemia-reperfusion.

ATP-P2X7 嘌呤信号通路介导脑缺血-再灌注损伤已成为病理生理的新观点，然而嘌呤信号通路在H2S抗损伤保护脑中的作用无研究报告。在前期工作已证实H2S对缺血脑有保护作用的基础上，以脑缺血-再灌注损伤大鼠和氧糖剥夺培养细胞为模型，采用活体微透析、RNA干扰、膜片钳等实验技术，运用激动剂、拮抗剂等药理学手段，深入研究内、外源性H2S对ATP释放方式和降解速度，神经元和胶质细胞P2X7嘌呤受体表达和活性，跨膜电流、胞内[Ca2+]i、肿瘤坏死因子、白介素1β、NO浓度等指标的影响，从受体前（ATP 的释放与代谢）、受体（P2X7表达和活性）、受体后（胞内信号转导）三个层次求证H2S对ATP-P2X7嘌呤信号通路调控的规律，确立"H2S抗脑缺血-再灌注损伤作用的嘌呤机制"的工作假说，以发现一种内源性神经保护的新机制，为缺血-再灌注损伤的临床防治提供新思路。

H2S抗损伤保护细胞的作用已有不少报道，但其机制尚不明晰。我们前期研究发现大鼠脑缺血-再灌注时内源性H2S/CBS体系有动态变化，皮层神经元P2X7受体表达增加。而H2S外源性供体 NaHS可减轻ATP诱导的PC12细胞损伤，取得了H2S调控ATP-P2X7信号通路的第一手证据。由此我们提出了H2S抗脑缺血损伤的嘌呤信号假说。为求证这一假说，制备了脑缺血-再灌注动物模型、氧糖剥夺（OGD）及ATP损伤细胞模型，从神经元和小胶质细胞的双重角度，在受体前（胞外ATP释放及代谢的调控）、受体（P2X7受体表达及功能的调控）和受体后（胞内信号通路的调控）三个水平上研究H2S对ATP-P2X7信号通路的影响。实验结果显示：1.在受体前水平，OGD后PC12细胞外ATP浓度明显增加，细胞活力下降；而H2S则上调ATP酶CD39的表达，加速胞外ATP的水解，降低胞外ATP浓度，减轻OGD诱导的细胞损伤。2.在受体水平，缺血-再灌注损伤后脑内神经元和OGD处理的神经元样细胞，P2X7受体表达明显增多，高浓度ATP 处理的细胞株（PC12细胞、SHY-5Y细胞和小胶质细胞）P2X7受体也上调，P2X7受体激活指标胞内Ca2+和YO-PRO-1摄入明显增加，与这些细胞的凋亡正相关。NaHS则可下调缺血-再灌注脑组织和ATP诱导的培养细胞中P2X7受体表达，抑制ATP引起的胞内Ca2+增加和YO-PRO-1摄入，减轻细胞损伤。表明H2S可通过对P2X7受体表达和功能的双重调控而起到神经保护作用。3.受体后水平，胞外高浓度ATP可以活化大鼠小胶质细胞，上调MAPK相关蛋白表达，增加TNF-α、IL-6等促炎细胞因子的释放，NaHS能明显下调ATP诱导的胞内Ca2+信号，减轻钙超载，抑制小胶质细胞的活化和促炎细胞因子的释放，逆转ATP 的上述效应。在脑缺血-再灌注大鼠的实验显示：NaHS可激活PI3K/Akt信号，抑制凋亡相关蛋白表达，减少神经元凋亡。总之，H2S可促进胞外ATP的水解、抑制P2X7受体表达和功能、调制胞内Ca2+和PI3K/Akt信号，抑制小胶质细胞的活化和促炎细胞因子的释放，在缺血-再灌注脑损伤中有神经保护作用。本研究在多层次探讨了H2S对ATP-P2X7受体信号通路的调控作用，揭示了H2S神经保护的新机制，为缺血-再灌注损伤的临床治疗提供了新思路。