聚乙二醇修饰抗菌多肽的自组装行为与生物活性研究

当前，细菌耐药性问题日益严重，这使在自然界中广泛存在且细菌不易对其产生耐药性的抗菌多肽成为研究热点。国外有10多个抗菌肽进入临床试验，但多数抗菌肽存在易被蛋白水解酶分解、体内活性低等缺陷。聚乙二醇（PEG）修饰多肽药物能提高其抗蛋白酶降解的能力，但往往因高分子量PEG的位阻等原因导致活性明显降低，甚至完全失活。 .本课题用一系列低分子量PEG修饰蜂毒肽片段、人源抗菌肽及自行设计的高活性抗菌肽,研究修饰物的聚集状态及影响因素，并利用修饰后的自组装行为，提高多肽抗蛋白酶降解的能力，同时,因所用PEG分子量低,能保持较高的抗菌活性。研究内容:1）PEG化多肽的自组装行为：胶束化、二次聚集、凝胶化等；2）影响聚集状态的因素：多肽序列、疏水性、构象、PEG分子量、溶液pH值等；3）PEG修饰对抗菌肽的抗菌、抗蛋白酶降解及其在血清中抗菌活性和稳定性的影响及其机理。

本研究采用优化的固相合成和聚乙二醇羧酸化方法，合成了系列抗菌肽并对其进行了聚乙二醇修饰，研究多肽及修饰产物的聚集状态、生物活性、抗菌机理、凝胶化行为等。（1）设计合成了3条富含甘氨酸、赖氨酸、亮氨酸的多肽，其一级结构中碱性氨基酸分散，但形成α-螺旋结构时，碱性氨基酸分布在α-螺旋同一侧，疏水性氨基酸分布在α-螺旋另一侧，含16个氨基酸残基的多肽为PA：G（m）K（n）L（o），以之为模板，对其中的两个甘氨酸用1个和2 个疏水性氨基酸Leu取代，得到疏水性渐次增强的多肽PB，PC。采用低分子量的聚乙二醇修饰这三个多肽。实验表明，该组抗菌肽疏水性强，抗菌活性高，经聚乙二醇修饰后的抗菌活性同样很高；其抗菌机理为典型的破坏细菌细胞膜的作用机制，经聚乙二醇修饰后的抗菌机理同样是破坏细菌细胞膜作用；修饰后的多肽抗蛋白酶降解能力有不同程度的提高；多肽本身的疏水性越强，抗菌活性越高，修饰后抗蛋白酶降解能力提升效果也越明显。圆二色谱测试发现这是一组呈现典型的α-螺旋构象的多肽，动态光散射等证实，修饰后的抗菌肽呈现一定的聚集状态，但修饰后的产物并未因其两亲性而自组装形成典型的胶束结构。（2）设计合成了N端、C端顺序相反的两条富含甘氨酸、赖氨酸、亮氨酸的多肽，其碱性氨基酸集中在一端，用两种不同分子量的PEG对这两个多肽进行修饰。实验证明，两组多肽的修饰产物同样发生了聚集，修饰后其动态力学直径分布在几十纳米和几百纳米两个区间。修饰后的多肽水溶性大幅度提高，其对人血红细胞的破坏作用较多肽本身呈现不同程度的降低。（3）设计合成了能够跨过细胞膜且与DNA有一定结合能力的抗菌肽CP，用聚乙二醇对其进行修饰；修饰产物的抗菌活性完全消失，证实聚乙二醇修饰策略对跨膜多肽的生物活性影响很大，对跨膜发挥抗菌作用的多肽不宜用该策略进行修饰。（4）研究了蜂毒肽类似物rMA(RKRKIWLILALLG )及其聚乙二醇修饰物的抗菌活性和聚集状态；实验表明，经聚乙二醇修饰后的多肽rMA在体外抗菌活性明显降低，动态光散射等研究表明聚乙二醇修饰的rMA呈现了明显的聚集，其流体力学半径在几十纳米和几百纳米之间有两个分布，用芘增溶等方法研究其胶束化行为时，同样未发现明显的胶束增溶效果。（5）深入研究了聚乙二醇修饰蜂毒肽抗菌有效片段类似物MA((GLLALILWIKRKR))的凝胶化行为，提出了其可能的凝胶化行为机理。