SIRT1 对氧化应激诱导的EPCs功能障碍的调节和机制研究

Silent information regulator 1 (SIRT1), a NAD dependent deacetylase,has importnant roles in modulation of cell function. We previously have shown that oxidative stress induced endothelial progenitor cell (EPCs) dysfunction was associated with FoxO3a nuclear translocation. Recent studies have suggested that FoxO3a activity is also controlled by the deacetylase SIRT1 and host cell factor 1(HCF1) .To date, however, the role of SIRT1 in modulation of EPCs function in response to oxidative stress and the underlying molecular mechanism have not been completely understood and needs to be elucidated further.Accordingly, we bring forward the hypothesis that oxidative stress may influence HCF1 acetylation level through downregulation of SIRT1 avtivity,resulting in change in FoxO3a target gene expression and EPCs dysfunction.To test this hypothesis, RT-PCR, Western blot,immunoprecipitation,adenoviral mediated gene transfer and RNA interference are performed on hydrogen peroxide treated human endothelial progenitor cells, D-galactose induced oxidative stress animal model and ApoE-/- mice athrosclerosis animal model to determine SIRT1 activity on modulation of EPCs function in response to oxidative stress.In addition,by these methods,mechanisms of modulation on EPCs function by SIRT1 was also determined from levels of molecular and cell to whole animal model. The present study is raised based on existing results obtained from our laboratory. Results of this study may provide a novel and reasonable explanation for oxidative stress induced EPCs dysfunction and may also provide a new target for future study aiming at improving EPCs function.

去乙酰化酶SIRT1对细胞功能具有重要调节作用。我们前期结果显示，氧化应激诱导的内皮祖细胞（EPCs）功能障碍与FoxO3a胞核转位有关。新近有研究发现，胞核中FoxO又受到SIRT1和HCF1的调节。但迄今对氧化应激条件下，SIRT1与EPCs功能的关系仍知之甚少，其调节的机制有待进一步探讨。为此我们提出假说：氧化应激通过下调 SIRT1表达和活性影响HCF1乙酰化水平，引起FoxO3a靶基因表达变化，导致EPCs功能障碍。为验证这一假说，我们将通过人EPCs，大鼠氧化应激模型和小鼠动脉粥样硬化模型，采用RT-PCR，Western blot，免疫共沉淀、腺病毒载体转染、RNA干扰等手段，从分子、细胞、动物整体水平等多方面探讨氧化应激条件下SIRT1表达和活性变化对EPCs功能的调节作用，明确SIRT1调节EPCs功能的机制。本研究结果为今后改善EPCs功能修复受损内皮提供新思路。

本研究基于内皮祖细胞的细胞治疗在各种缺血性和血管损伤性疾病的治疗中的应用前景。氧化应激会明显降低内皮祖细胞的功能和数量。SIRT1通过对包括FOXOs在内的底物的去乙酰化作用，在多种病理生理过程中发挥重要的调控作用。在氧化应激条件下，SIRT1对内皮祖细胞功能的调控作用却并不清楚。我们前期研究发现，FOXO3a是内皮祖细胞中的主要表达亚型，它能通过转录调控其靶基因Bim的表达而引起内皮祖细胞功能障碍。FOXOs的功能受转录后修饰的调控，如乙酰化，但是SIRT1对FOXO3a去乙酰化后，FOXO3a蛋白的变化却不清楚。本研究通过密度梯度离心法从人脐血中分离培养出EPCs，通过形态学、细胞表面标志物、摄取Dil-Ac-LDL和结合FITC-UEA-1的能力以及体外血管形成能力对其进行鉴定。H2O2(过氧化氢)处理内皮祖细胞诱导氧化应激，CCK-8检测细胞存活情况，基质胶观察体外血管生成能力，DNA片段检测细胞凋亡，免疫荧光检测SIRT1的细胞定位， Western Blot检测SIRT1、FOXO3a、Bim、Bax和cleaved caspase-3的蛋白表达水平，qPCR检测SIRT1和FOXO3a的mRNA表达水平,腺病毒介导的转染用来过表达或沉默SIRT1，免疫共沉淀检测SIRT1和FOXO3a的相互作用、FOXO3a的乙酰化水平和FOXO3a的泛素化水平。内皮祖细胞能摄取Dil-Ac-LDL和结合FITC-UEA-1，高表达CD34、CD133和VEGFR-2，具有体外血管形成能力。SIRT1位于细胞核中，且H2O2并不改变其细胞定位。H2O2处理24小时能明显上调SIRT1蛋白水平。H2O2能剂量依赖的降低细胞存活率、降低体外血管形成能力和增加细胞凋亡。SIRT1过表达缓解H2O2诱导的内皮祖细胞功能障碍，SIRT1沉默和EX527（SIRT1特异性抑制剂）表现出相反作用。SIRT1过表达降低细胞内FOXO3a蛋白总量，而SIRT1沉默和EX527增加FOXO3a蛋白总量。SIRT1降低FOXO3a的转录活性。SIRT1能够直接结合FOXO3a,降低其乙酰化水平和增加其泛素化水平。本研究的意义在于 SIRT1对氧化应激诱导的内皮祖细胞功能障碍起保护作用，机制可能是通过对FOXO3a的泛素化和随后的降解来抑制FOXO3a蛋白表达和转录活性来实现的。