VDAC1在葡萄糖氧化酶诱导的大鼠耳蜗边缘细胞氧化应激损伤中的门控机制研究

Damage or dysfunction of cochlear lateral wall stria vascular marginal cells is regarded as the key factor cause to oxidative stress related sensorineural deafness. Mitochondria of voltage dependent anion channel 1 (VDAC1) is referred to as the "gatekeeper" of mitochondria, not only regulate mitochondrial metabolism exchange inside and outside, at the same time may also directly or indirectly change the mitochondrial membrane permeability mediated cell apoptosis. Our previous studies have found that Glucose oxidase (GO) can induce the MCs oxidative stress damage, mitochondrial membrane permeability increased, mitochondria inner membrane protein release and cause to mitochondrial cascade apoptotic, Which associated with an increase in abnormal expression of VDAC1, as well as mitochondria Ca2+ concentration accumulation, that all can be inhibited by superoxide dismutase (SOD). Prompt us to think that VDAC1-Ca2 + may play a role in the MCs oxidative stress damage, overexpression of VDAC1 may associated with the permeability of the mitochondrial membrane. Our Studied aim to using the methods of molecular biology, morphology in the brand-new Angle of mitochondrial to explore the gating mechanism of VDAC1/Ca2+/mPTP signal cascade in MCs oxidative stress damage. In order to find out the hot-targets by which the oxidative stress injury initiate the MCs apoptosis mediated by mitochondrial, and to provide new way in the clinical treatment for sensorineural deafness caused by oxidative stress damage.

耳蜗外侧壁边缘细胞（MCs）的功能障碍被认为是氧化应激相关性感音神经性聋的关键原因。研究证实，有线粒体“看门人”之称的电压依赖性阴离子通道1（VDAC1），在调控线粒体内外代谢交换的同时，还可能直接或间接改变线粒体膜透性而介导细胞凋亡，但其具体调控机制不明。我们前期研究发现用葡萄氧化酶（GO）能诱导MCs氧化应激损伤，线粒体膜透性增加、内膜蛋白释放等线粒体级联途径凋亡，同时伴有VDAC1表达异常增加，以及线粒体Ca2+蓄积，且能被超氧化物歧化酶抑制。提示VDAC1- Ca2+可能参与MCs氧化应激损伤，VDAC1过表达可能与线粒体膜的渗透性相关。本研究拟利用分子生物学、形态学等方法从线粒体膜透性的全新角度探讨VDAC1/Ca2+/ mPTP信号级联对MCs氧化应激损伤的门控机制。以期找出氧化应激损伤通过线粒体启动MCs凋亡的重要靶点，为临床治疗氧化应激损伤所致感音神经性耳聋提供新的思路。

前期研究证实线粒体的功能障碍是耳蜗外侧壁边缘细胞（MCs）损伤从而导致氧化应激相关性感音神经性聋的关键原因。我们采用原代培养的大鼠耳蜗MCs为研究对象，我们发现线粒体膜蛋白电压依赖性阴离子通道1（VDAC1）的表达以及线粒体Ca2+水平与MCs氧化应激呈正相关，因此我们提出VDAC1可能通过调控细胞内Ca2+ 的内稳态介导对线粒体渗透性转换孔（mPTP）的调控作用；对MCs氧化应激损伤具有门控作用的假设。本研究通过建立GO诱导大鼠耳蜗MCs氧化应激模型，并利用Ad-VDAC1-siRNA感染MCs下调VDAC1的表达，通过流式细胞技术，免疫荧光，western-blot，免疫共沉淀，化学发光法等技术观察MCs的线粒体损伤情况，以及线粒体内膜蛋白的移位，凋亡相关指标检测等。我们发现：1）GO诱导下， MCs同时发生caspase经典凋亡路径以及Parthanatos死亡路径的损伤，并且都是循线粒体损伤的途径发生。2）证实了VDAC1在MCs氧化应激损伤中的门控作用，通过Ad-VDAC1-siRNA下调VDAC1的表达能够显著下调线粒体损伤的关键指标，从而缓解GO 诱导的MCs氧化应激损伤，提高MCs生存率。3）mPTP在介导MCs氧化应激损伤的过程中具有关键作用，在氧化应激刺激后，mPTP抑制剂CsA能够使MCs维持在较高的线粒体膜电位, 从而阻止线粒体途径发生的细胞损伤。4）后续研究将继续对VDAC1-mPTP与MCs线粒体钙离子过量摄取，内质网钙游出之间的关系进行探索。科学意义：本项目通过研究氧化应激状态下新生大鼠耳蜗血管纹边缘细胞氧化应激损伤的机制，探索线粒体膜重要蛋白VDAC1与mPTP以及细胞内钙离子内稳态之间的关系，对阐明线粒体VDAC1-mPTP-Ca2+信号轴在感音神经性聋病理机制中的作用有重要意义。